MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER MEDIANTE UN ANTICUERPO MONOCLONAL.

Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer mediante un anticuerpo monoclonal CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al diagnóstico de trastornos neurológicos, especialmente al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer mediante un anticuerpo capaz de interaccionar con péptidos específicos asociados con dicha enfermedad. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ES 2 367 837 T3 La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurológico que provoca la muerte de las células nerviosas del cerebro. Por lo general, progresa paulatinamente, comenzando después de los 50 años, y sus primeros síntomas pueden atribuirse a la vejez o al olvido común. A medida que avanza la enfermedad, se van deteriorando las capacidades cognitivas, entre ellas, la capacidad para tomar decisiones y llevar a cabo las tareas cotidianas, y pueden surgir modificaciones de la personalidad, así como conductas problemáticas. En sus etapas avanzadas, la EA conduce a la demencia y finalmente a la muerte. La enfermedad es actualmente incurable y constituye una causa importante de mortalidad. En la actualidad, el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer se realiza normalmente a través del cuadro clínico, pues el diagnóstico definitivo sólo puede llevarse a cabo mediante un estudio histológico de muestras cerebrales (autopsia o biopsia), que revele la presencia en el tejido cerebral de sus rasgos característicos. Debido a la peligrosidad de la práctica de biopsias cerebrales en pacientes vivos, este procedimiento se utiliza muy raramente, por lo que se estima que la tasa de errores en el diagnóstico in vivo de esta enfermedad ronda el 20%-30%. Los cerebros de los individuos que padecen enfermedad de Alzheimer muestran dos marcadores patológicos principales: degeneración neurofibrilar (que se identifica por la presencia de ovillos neurofibrilares, neuritas distróficas y hebras del neuropilo) y depósitos de sustancia amiloide (es decir, depósitos del denominado péptido amiloide, abreviado generalmente como A), tanto en forma de placas (placas difusas y placas neuríticas, formas estas últimas características de la enfermedad, que se denominan así por aparecer entre y dentro de las neuronas), como en forma de depósitos vasculares (que aparecen en las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales). Tanto la degeneración neurofibrilar como la deposición amiloide representan procesos degenerativos asociados también al envejecimiento normal del cerebro. En los sujetos de avanzada edad que no padecen demencia, el péptido A se deposita principalmente en forma de placas difusas. Este tipo de depósito es especialmente intenso en algunos sujetos con capacidades cognitivas normales, y para algunos autores representa un proceso de "envejecimiento patológico", que se considera que está a medio camino entre el envejecimiento normal del cerebro y la EA [1]. Un desarrollo particularmente intenso y prematuro de placas difusas años antes de que aparezcan las placas neuríticas tiene lugar también en el síndrome de Down (SD), debido a una trisomía del cromosoma 21 que conduce a una sobreexpresión de la proteína precursora amiloide (-APP). Aunque se puede observar un pequeño número de placas neuríticas en cerebros de sujetos con capacidades cognitivas normales, tanto los cerebros afectados por EA como los afectados por SD en edades avanzadas se caracterizan por el desarrollo de una gran cantidad de placas neuríticas maduras [2, 3]. En contraste con las placas difusas, que contienen una forma no fibrilar de A (denomina preamiloide) [4], tanto los depósitos amiloides vasculares como las placas neuríticas contienen péptido A en forma fibrilar y reaccionan con tinciones de sustancia amiloide tales como el Rojo Congo y la Tioflavina T. El declive cognitivo en la EA se correlaciona de forma lineal con la progresión de los cambios neurofibrilares y la pérdida de sinapsis corticales [5]. No se ha observado pérdida local de sinapsis asociada a las placas difusas [6]. En contraste, las placas neuríticas están asociadas con pérdida de densidad sináptica, cambio neurofibrilar y activación de la microglía [7]. Tanto el cambio neurofibrilar puro como la deposición de A siguen en la EA patrones secuenciales de progresión bien establecidos [8, 9]. Sin embargo, aunque el grado de declive cognitivo se correlaciona mejor con una sucesión de etapas basadas en el cambio neurofibrilar [5], el diagnóstico neuropatológico definitivo de la EA se basa todavía en la demostración histológica de una densidad significativamente mayor de placas neuríticas en las regiones neocorticales asociativas, con respecto a lo esperado según el grupo de edad del paciente, dentro de un cuadro clínico de demencia (criterios de consenso del CERAD: Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease) [10]. La formación de placas neuríticas representa el proceso patogénico central en la EA, y la composición molecular de estos depósitos -amiloides y las diferencias con las placas difusas en lo que a dicha composición se refiere es, en consecuencia, uno de los principales campos de interés en la investigación actual sobre la EA. El conocimiento que se posee sobre la composición molecular de los depósitos -amiloides en el tejido cerebral de pacientes con enfermedad de Alzheimer ha cambiado radicalmente a lo largo de los últimos años. Varios estudios que empleaban métodos bioquímicos o inmunohistoquímicos con el fin de identificar diferentes formas del péptido A han aportado una imagen bastante consistente que permite una interpretación molecular de los hallazgos morfológicos clásicos. Estos estudios son los que han proporcionado las bases de la teoría patogénica unitaria de la enfermedad denomina hipótesis amiloide [11], aunque la hipótesis original se ha reformulado recientemente con el fin de incluir el papel emergente de los oligómeros A solubles como los principales agentes patógenos [12]. La 2 ES 2 367 837 T3 suposición de un papel patógeno central y primario de los péptidos A en la EA está dando lugar en la actualidad a nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la prevención o eliminación de estos depósitos. La distribución topográfica y secuencia temporal de la deposición de péptidos A conocidos en cerebros afectados por EA se ha dilucidado con la ayuda de anticuerpos dirigidos al extremo carboxilo, al extremo amino o a segmentos 5 internos de la molécula A, junto con el aislamiento y purificación de isoformas de A por medio de métodos bioquímicos. La distribución tisular de péptidos caracterizados por los rasgos de sus extremos carboxilo muestra un patrón bastante regular y bien definido. Mientras que AX-40 es la forma predominante en los depósitos vasculares y es la forma principal que se encuentra en el LCR (líquido cefalorraquídeo), AX-42 es la forma principal detectada en los depósitos de tejido cerebral (placas difusas y neuríticas) [13]. En la EA, el síndrome de Down (SD) [13, 14] y el 10 envejecimiento normal [1] AX-42 es el único componente de las placas difusas y el componente principal de las placas neuríticas. Estas últimas también pueden contener AX-40, predominantemente en la región de su núcleo central. También se ha establecido que AX-42 es la forma que se deposita en las fases iniciales. Aunque inicialmente se creía que AX-40 y AX-42 comenzaban casi en su totalidad en el aminoácido Asp1, está bien establecido inmunohistoquímica y bioquímicamente que una amplia variedad de isoformas heterogéneas del péptido 15 A modificadas y truncadas en el extremo amino, participan en la composición de las placas tanto difusas como neuríticas [15]. Estas isoformas tienden a mostrar también un patrón regular de distribución entre las placas difusas y neuríticas, de forma que finalmente ha comenzado a surgir una imagen completa de la distribución topográfica de los diferentes péptidos A. Sin embargo, existen todavía algunas discrepancias entre los estudios, particularmente con respecto a las características del extremo amino de los péptidos que componen las placas difusas, y la cantidad 20 relativa de carga amiloide que representa cada uno de ellos. Estas discrepancias implican particularmente al péptido p3 (A17-42). Mientras que algunos estudios sugieren que A17-42 puede ser el principal componente de las placas difusas [16], otros han encontrado una cantidad relativamente mayor de formas más largas (que comienzan en Asp1, o truncadas en el extremo amino u otras isoformas modificadas) a este nivel [15]. Puesto que A17-42 se genera mediante la escisión de -APP por la ­ 25 secretasa (la denominada ruta no amiloidogénica) y muestra propiedades físico-químicas bastante diferentes de las isoformas más largas de A (estas últimas generadas mediante la escisión de -APP por la -secretasa), su presencia selectiva en placas difusas puede tener un significado... 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1.- Un anticuerpo monoclonal que reconoce en el péptido -amiloide al menos el epítopo correspondiente a la secuencia: Val-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO:3), cuya afinidad de unión a A1-42 es mayor que la afinidad de unión a A1­ 40, ambas medidas por ELISA y es capaz de unirse selectivamente a placas neuríticas y a depósitos amiloides vasculares de isoformas del péptido -amiloide humano que contengan dicha secuencia en tejido cerebral y a formas solubles del péptido -amiloide humano en muestras de fluidos biológicos o soluciones derivadas de los mismos. 2.- Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, capaz de unirse selectivamente a formas solubles del péptido amiloide humano en muestras de fluidos biológicos o soluciones derivadas de los mismos seleccionadas del grupo: sangre, plasma u orina. 3.-El anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 1 ó 2 producido por la línea celular de hibridoma ECACC 06030101. 4.- Una línea celular de hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 1 ó 2. 5.- Línea celular de hibridoma según la reivindicación 4, obtenida mediante la fusión con la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag.653 de células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con al menos un péptido que contenga la secuencia Val-His-His-Gln-Lys (SEQ ID NO:3). 6.- Línea celular de hibridoma según la reivindicación 4, obtenida mediante la fusión con la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag.653 de células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con el péptido A1-40. 7.- Línea celular de hibridoma según la reivindicación 6, obtenida mediante la fusión con la línea de mieloma de ratón P3/X63-Ag.653 de células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con el péptido A1-40 acoplado a KLH. 8.- Línea celular de hibridoma según la reivindicación 7 que comprende en una muestra sustancialmente pura de ECACC 06030101. 9.- Uso del anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de tejido cerebral tomada de un individuo aquejado de dicha enfermedad. 10.- El uso según la reivindicación 9 donde el estado de progresión de la enfermedad se correlaciona con la presencia en la muestra de un subconjunto de placas neuríticas que se ponen de manifiesto mediante su unión al anticuerpo monoclonal. 11.- Una composición que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 acoplado a una sustancia que permite la detección de dicho anticuerpo. 12.- Composición según la reivindicación 11, en la que la sustancia a la que se acopla el anticuerpo monoclonal es un segundo anticuerpo capaz de unirse a dicho primer anticuerpo, estando unido este segundo anticuerpo a una enzima capaz de catalizar la transformación de una determinada sustancia en otra que pueda ser detectada. 13.- Composición según la reivindicación 12, en la que la sustancia cuya transformación cataliza la enzima es un cromógeno. 14.- Composición según las reivindicaciones 12 y 13, en la que el segundo anticuerpo está unido a fosfatasa alcalina y el cromógeno utilizado es azul de nitro-tetrazolio. 15.- Composición según las reivindicaciones 12 y 13, en la que el segundo anticuerpo está unido a peroxidasa de rábano y el cromógeno utilizado es diaminobencidina. 16.- Composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, que comprende al menos otro anticuerpo específico para al menos una zona de secuencia diferente del péptido -amiloide. 17.- Composición según la reivindicación 16, que comprende el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 acoplado a una sustancia que puede ser detectada y otro u otros anticuerpos específicos para una o más zonas de secuencia diferentes del péptido -amiloide, acoplados a sustancias diferentes que también pueden ser detectadas. 18.- Composición según la reivindicación 17, en la que el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 está acoplado a un segundo anticuerpo unido a peroxidasa de rábano, utilizándose como sustancia a transformar que puede ser detectada el cromógeno diaminobencidina (DAB). 19.- Composición según la reivindicación 17, en la que el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 está acoplado a un segundo anticuerpo unido a peroxidasa de rábano utilizándose como sustancia a transformar que puede ser detectada el cromógeno azul de nitro-tetrazolio. 19 ES 2 367 837 T3 20.- Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de tejido cerebral tomada de un individuo aquejado de ella. 21.- Un método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de tejido cerebral tomada de un individuo aquejado de ella, que comprende la detección en la misma de la presencia de placas neuríticas y depósitos amiloides vasculares mediante el anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 3. 22.- Método según la reivindicación 21, donde el anticuerpo monoclonal está comprendido en una composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19. 23.- Método según la reivindicación 21, donde la presencia de placas neuríticas detectadas mediante el anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 1 a 3 se correlaciona con el estado de progresión de la enfermedad. 24.- Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, donde la presencia de la isoforma A1-40 del péptido amiloide en las placas neuríticas detectadas mediante el anticuerpo monoclonal se conforma a través de la unión de un anticuerpo específico de la región carboxiterminal de la isoforma A1-40 del péptido -amiloide. 25.- Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, donde la presencia de placas neuríticas adicionales y/o placas difusas es detectado mediante la unión de un anticuerpo específico de la región carboxiterminal de la isoforma A1-42 del péptido -amiloide. 26.- Una composición que comprende un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo está acoplado a una sustancia o partícula que facilita la extracción de complejos antígeno-fragmento de anticuerpo de la solución en la que se encuentran. 27.- Una composición según la reivindicación 26, en la que la sustancia o partícula que facilita la extracción de complejos antígeno-fragmento de anticuerpo de la solución en la que se encuentran es una partícula magnética. 28.- Una composición según la reivindicación 27, en la que la unión entre el anticuerpo y la partícula magnética es una unión covalente. 29.- Uso del anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 1 ó 2 en el diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de un fluido biológico o de una solución derivada del mismo. 30.- Uso según la reivindicación 29, en el que el anticuerpo monoclonal está comprendido en una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28. 31.- Uso según la reivindicación 30, en el que la composición según las reivindicaciones 26 a 28 se añade a la muestra de fluido biológico o a la solución derivada del mismo para que se formen complejos antígeno-anticuerpo con las formas del péptido -amiloide presentes en la muestra de fluido biológico o la solución derivada del mismo. 32.- Uso según la reivindicación 31, en el que se provoca la extracción de complejos antígeno-fragmento de anticuerpo formados del fluido biológico o la solución en la que se encuentran mediante el uso de un campo magnético. 33.- Uso según la reivindicación 32, en el que las formas del péptido -amiloide extraídas de un fluido biológico o una solución derivada del mismo en forma de complejos antígeno-anticuerpo se separan del anticuerpo posteriormente a su extracción del fluido biológico o la solución en la que se encontraban y antes de proceder a su identificación y/o cuantificación. 34.- Uso según la reivindicación 33, en el que las formas del péptido -amiloide se identifican y/o cuantifican mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. 35.- Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en el que la muestra de fluido biológico es una muestra de orina. 36.- Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, en el que el estado de progresión de la enfermedad de Alzheimer se correlaciona con la concentración de la isoforma A1-42 en la muestra. 37.- Un método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer a partir de una muestra de un fluido biológico o de una solución derivada del mismo que comprende las etapas de: a) añadir a la muestra de fluido biológico o la solución derivada del mismo una composición según las reivindicaciones 26 a 28; b) dejar transcurrir tiempo suficiente para que se formen complejos antígeno-fragmento de anticuerpo entre al menos una isoforma del péptido -amiloide y el anticuerpo comprendido en la composición; c) aplicar un campo magnético para extraer los complejos antígeno-fragmento de anticuerpo de la solución; d) retirar la solución; ES 2 367 837 T3 e) separar el anticuerpo de las moléculas de péptido -amiloide; f) identificar y cuantificar las isoformas de péptido -amiloide extraídas de las muestra de fluido biológico o solución derivada del mismo. 5 38.- Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 37, en el que la muestra de fluido biológico es una muestra de orina. 39.- Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 37, en el que la composición que se añade en la etapa a) comprende un anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 1 ó 2, unido covalentemente a las correspondientes partículas magnéticas mediante la modificación de uno o más restos presentes 10 en la zona Fc de dicho anticuerpo. 40.- Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 39, en el que la identificación y cuantificación de las isoformas del péptido -amiloide extraídas de la muestra de orina se realiza mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. 41.- Método de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 40, en el que la etapa e) de 15 separación del anticuerpo o fragmento del anticuerpo de las moléculas de péptido -amiloide se realiza en ácido ciano-4-hidroxicinámico en acetonitrilo acuoso que contiene ácido trifluoroacético. 21 ES 2 367 837 T3 Figura 1 22 ES 2 367 837 T3 23 Figura 2 ES 2 367 837 T3 24 Figura 3 ES 2 367 837 T3 Figura 4 ES 2 367 837 T3 Figura 5 26 ES 2 367 837 T3 27 Figura 6 ES 2 367 837 T3 28 Figura 7 REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción Literatura no patente citada en la descripción ES 2 367 837 T3 29 ES 2 367 837 T3