DIFERENCIAS MOLECULARES ENTRE ESPECIES DEL COMPLEJO M. TUBERCULOSIS.
Polipéptido codificado por al menos 25 nucleótidos del marco de lectura abierta Rv2654c
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US99/17939.
Solicitante: THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 900 WELCH ROAD, SUITE 350,PALO ALTO, CA 94304-1850.
Inventor/es: WILSON, MICHAEL A., BEHR,MARCEL,DIV. INF. DISEASE/MED. MICROBIOLOGY, SMALL,PETER,DIV. INF. DISEASE/GEOG. MEDICINE, SCHOOLNIK,GARY,BECKMAN CENTER.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 28 de Abril de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68M10B
Clasificación PCT:
- C12N1/21 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/11 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
Clasificación antigua:
- C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
- C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
Fragmento de la descripción:
Diferencias moleculares entre especies del complejo M. tuberculosis.
La tuberculosis es una lacra humana antigua que sigue siendo un importante problema de salud pública en todo el mundo. Es una epidemia en curso de proporciones asombrosas. Aproximadamente una de cada tres personas en el mundo está infectada con Mycobacterium tuberculosis, y tiene un riesgo de por vida del 10% de avance de la infección a la enfermedad clínica. Aunque la tuberculosis se puede tratar, se estima que 2,9 millones de personas murieron a causa de la enfermedad el año pasado.
Hay problemas significativos con la dependencia en el tratamiento farmacológico para controlar las infecciones activas de M. tuberculosis. La mayoría de las regiones con altos índices de infección son los países menos desarrollados, que sufren de una falta de servicios de salud accesibles fácilmente, servicios de diagnóstico y los antibióticos adecuados frente a M. tuberculosis. Incluso cuando estos están disponibles, el cumplimiento por parte del paciente suele ser deficiente debido al largo régimen necesario para el tratamiento completo, y las cepas resistentes a múltiples fármacos son cada vez más comunes.
La prevención de la infección eludiría los problemas de tratamiento, por lo que la vacunación contra la tuberculosis se realiza extensamente en las regiones endémicas. Alrededor de 100 millones de personas al año son vacunadas con bacilo de Calmette-Guerin (BCG) vivo. El BCG tiene la gran ventaja de ser barato y puede administrarse con facilidad bajo circunstancias menos que óptimas, con pocas reacciones adversas. Desafortunadamente, la vacuna es muy variable en su eficacia, proporcionando en cualquier lugar de un 0 a un 80% de protección contra la infección con M. tuberculosis.
El BCG tiene una historia interesante. Se trata de una cepa atenuada de M. bovis, un pariente muy cercano del M. tuberculosis. La cepa de M. bovis que se convirtió en BCG fue aislada de una vaca en la década de 1800 por parte de un bacteriólogo llamado Nocard, por lo que fue llamado bacilo de Nocard. La atenuación del bacilo Nocard tuvo lugar desde 1908 hasta 1921, a lo largo de 230 pasos in vitro. A partir de entonces, se cultiva ampliamente en todo el mundo, resultando en cientos adicionales y a veces miles de pasos in vitro. A lo largo de sus muchos años en el laboratorio, ha habido la selección de la reacción cruzada con la prueba cutánea de la tuberculina, y para disminuir los efectos secundarios. El resultado neto ha sido un agente patógeno debilitado considerablemente, lo que puede ser ineficaz en la producción de una respuesta inmunológica adecuada.
Nuevas vacunas contra la tuberculosis se necesitan con urgencia para la población general en las regiones endémicas, para las personas infectadas por el VIH, así como profesionales de la salud que puedan estar expuestos al bacilo de la tuberculosis. Se han desarrollando vacunas de ADN recombinante que llevan genes protectores de M. tuberculosis virulenta usando fásmidos de transporte para transferir material genético de una especie micobacteriana a otra, por ejemplo, ver la patente US 5.776.465. Al desarrollo de la vacuna de la tuberculosis se le debe dar una alta prioridad en los actuales objetivos de la investigación médica.
Literatura relevante
Mahairas et al. (1995) J Bacteriol 178 (5): 1274-1282 proporciona un análisis molecular de las diferencias genéticas entre BCG de Mycobacterium bovis y M. bovis virulenta. La hibridación genómica sustractiva fue utilizada para identificar las diferencias genéticas entre M. bovis virulenta y M. tuberculosis y BCG no virulenta, la patente US 5.700.683 se dirige a estas diferencias genéticas.
Cole et al. (1998) Nature 393: 537-544 han descrito el genoma completo de M. tuberculosis. Para obtener la secuencia contigua del genoma, se utilizó un enfoque combinado que implicó el análisis de secuencia sistemática de clones seleccionados de gran inserción, así como clones aleatorios de pequeña inserción de una librería de disparo del genoma completo. Esto culminó en una secuencia compuesta de 4.411.529 pares de bases, con un contenido de G + C del 65,6%. 3.924 marcos de lectura abierta se identificaron en el genoma, lo que representa ~91% de la capacidad potencial de codificación.
La secuencia genómica de Mycobacterium tuberculosis (M. tb.) está disponible en varios sitios de Internet, incluyendo http://www.cric.com/htdocs/tuberculosis/index.html y http://www.sanger.ac.uk/pathogen.
La solicitud de patente internacional WO 96/25519 describe supresiones genéticas atenuantes de la virulencia.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona procedimientos de diagnóstico, en particular de la tuberculosis, que implican el uso de, y composiciones que comprenden, un polipéptido codificado mediante por lo menos 25 nucleótidos del marco de lectura abierta Rv2654c.
Se proporcionan marcadores genéticos que distinguen entre las cepas del Mycobacterium tuberculosis complejo, en particular entre cepas no virulentas y virulentas. Las cepas de interés incluyen M. bovis, cepas de BCG de M. bovis, M. tuberculosis (M.tb.) aislado, y bacteriófagos que infectan las micobacterias. Los marcadores genéticos se utilizan para los ensayos, por ejemplo, inmunoensayos, que distinguen entre las cepas, tal como para diferenciar entre la inmunización de BCG y la infección M. tb. Los productos de proteína pueden producirse y utilizarse como inmunógenos, en el cribado de fármacos, etc. Los marcadores son útiles en la construcción modificada genéticamente de células M. tb. o M. bovis que tienen características mejoradas de la vacuna.
Descripción detallada de las realizaciones
Se identifican supresiones genéticas específicas, y específicamente Rv2654c, que sirven como marcadores para distinguir entre cepas de micobacterias no virulentas y virulentas, incluyendo cepas de M. bovis, BCG de M. bovis, M. tuberculosis (M.tb) aislado y bacteriófagos que infectan las micobacterias. Esta supresión se utiliza como marcador genético para distinguir entre las micobacterias diferentes. La supresión puede introducirse en M. tb. o M. bovis mediante procedimientos recombinantes con el fin de producir una cepa patógena no virulenta. Por otra parte, el gen suprimido se identifica en la secuencia del genoma M. tb., y luego de nuevo mediante procedimientos recombinantes en BCG u otras cepas de vacuna, para mejorar la eficacia de la vacunación.
La supresión de la invención se identifica mediante hibridaciones de ADN comparativo de secuencias genómicas de micobacterias de una micromatriz de ADN que comprende las secuencias representativas de las secuencias codificadoras de M. tb.. La supresión se asigna entonces a la secuencia del genoma M. tb. conocida para identificar específicamente los genes suprimidos, y para caracterizar la secuencia de nucleótidos de la región suprimida.
Los ácidos nucleicos que comprenden la supresión y las uniones proporcionadas se utilizan en una variedad de aplicaciones. Se pueden obtener sondas de hibridación a partir de la secuencia M. tb. conocida que se corresponde a las secuencias suprimidas. Estas sondas son útiles para distinguir entre las micobacterias. Por ejemplo, hay una probabilidad del 10% de que una persona infectada con M. tb. progrese a una enfermedad clínica, pero esa probabilidad puede variar dependiendo de la cepa infectante particular. Se utiliza un análisis para detectar la presencia o la ausencia de las supresiones previstas a continuación como "M. tb viable" para distinguir entre diferentes cepas de M. tb. Las supresiones son también útiles para identificar si un paciente que es positivo para la prueba cutánea de la tuberculina ha sido infectado con M. tb o con BCG.
En otra descripción de la solicitud, las micobacterias son alteradas genéticamente para suprimir las secuencias identificadas aquí como ausentes en las cepas atenuadas, pero presentes en las cepas patógenas, por ejemplo, supresiones en BCG, pero presentes en M. tb H37Rv. Estas cepas tratadas genéticamente pueden proporcionar vacunas de BCG superiores a los presentes aislamientos de BCG en uso. Alternativamente, las cepas de BCG puede ser "reconstruidas" para parecerse más a M. tb de tipo salvaje mediante la inserción de...
Reivindicaciones:
1. Polipéptido codificado por al menos 25 nucleótidos del marco de lectura abierta Rv2654c
![](/img/2010/08-reivindicaciones/diferencias-moleculares-especies-complejo-m-tuberculosis.1.png)
para su uso en un procedimiento de diagnóstico in vivo.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, codificado mediante el marco de lectura abierta Rv2654c para su uso, según la reivindicación 1, en el diagnóstico in vivo de la tuberculosis causada por un miembro del complejo de la tuberculosis.
3. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1, codificado mediante el marco de lectura abierta Rv2654c, en la fabricación de una composición para el diagnóstico in vivo de la tuberculosis causada por un miembro del complejo de la tuberculosis.
4. Polipéptido según la reivindicación 1, para su utilización según la reivindicación 1, en el que el polipéptido se fusiona con un socio de fusión.
5. Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización según alguna de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el miembro del complejo de la tuberculosis es Mycobacterium tuberculosis.
6. Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización según alguna de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el miembro del complejo de la tuberculosis es Mycobacterium bovis.
7. Procedimiento para determinar si un paciente ha estado expuesto a un miembro del complejo de la tuberculosis, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una muestra del paciente con un polipéptido codificado por lo menos 25 nucleótidos del marco de lectura abierto Rv2654c
![](/img/2010/08-reivindicaciones/diferencias-moleculares-especies-complejo-m-tuberculosis.2.png)
cuyo polipéptido que no tiene reactividad cruzada de exposición a la BCG; y determinar la presencia de una reacción inmune a dicho polipéptido, en el que una respuesta positiva es indicativa de la exposición a este complejo.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el miembro del complejo de la tuberculosis es Mycobacterium tuberculosis.
9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el miembro del complejo de la tuberculosis es Mycobacterium bovis.
10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha muestra comprende una muestra de sangre o derivado de la misma.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha etapa de determinación comprende: detectar la unión de un anticuerpo a dicho polipéptido, siendo dicha unión una indicación de que dicho sujeto está infectado por Mycobacterium tuberculosis o está enfermo con Mycobacterium tuberculosis.
12. Composición de diagnóstico que comprende el polipéptido codificado por al menos 25 nucleótidos del marco de lectura abierta Rv2654c:
![](/img/2010/08-reivindicaciones/diferencias-moleculares-especies-complejo-m-tuberculosis.3.png)
en combinación con un medio, adecuado para una inyección subcutánea.
13. Composición que comprende el polipéptido codificado por al menos 25 nucleótidos del marco de lectura abierta Rv2654c;
![](/img/2010/08-reivindicaciones/diferencias-moleculares-especies-complejo-m-tuberculosis.4.png)
en combinación con una muestra de sangre humana o derivado de la misma para su análisis.
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