PROCEDIMIENTO DE DIAGNOSTICO IN VITRO DE CARCINOMA BRONCOPULMONAR MEDIANTE DETECCION DE TRANSCRITOS MAYORITARIOS ALTERNATIVOS DEL GEN KLK8 QUE CODIFICA KALICREINA 8 Y SU UTILIZACION PARA EL PRONOSTICO DE SUPERVIVENCIA.

Procedimiento de diagnóstico in vitro de carcinoma broncopulmonar,

particularmente de carcinoma bronquial no microcítico, caracterizado porque comprende la etapa de detección, en una muestra biológica procedente de un paciente sospechoso de estar aquejado de dicho carcinoma broncopulmonar, de al menos uno de los transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8 que codifica kalicreína 8

Procedimiento de diagnóstico in vitro de carcinoma broncopulmonar mediante detección de transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8 que codifica kalicreína 8 y su utilización para el pronóstico de supervivencia.

La presente invención se refiere al ámbito de la oncología. Más particularmente, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de diagnóstico in vitro del carcinoma broncopulmonar primitivo en un paciente ser humano, mediante determinación de la presencia, más allá de un umbral predeterminado, de un transcrito mayoritario del gen KLK8 de kalicreína 8 en una muestra biológica procedente de este paciente.

El carcinoma broncopulmonar primitivo es la primera causa de muerte por cáncer en el hombre y esto en todos los países desarrollados. Datos recientes muestran un claro aumento de la incidencia en las mujeres. Se estima el número de nuevos casos al año en 25.000 en Francia y en más de 160.000 en los Estados Unidos, conllevando la muerte anual de aproximadamente 22.000 individuos en Francia y 155.000 en los Estados Unidos. A nivel mundial, el carcinoma broncopulmonar sería responsable de aproximadamente 900.000 muertes cada año, lo que correspondería aproximadamente al 18% de las muertes por cáncer. La etiología principal del carcinoma broncopulmonar es el tabaquismo. Aproximadamente el 90% de los carcinomas bronquiales en el hombre y aproximadamente el 50% en la mujer son atribuibles al tabaco. Otros factores ambientales o profesionales también pueden reconocerse en la carcinogénesis bronquial.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) distingue los carcinomas bronquiales microcíticos (CBM), que representan aproximadamente el 20% de los casos, y los carcinomas bronquiales no microcíticos (CBNM) que agrupan, entre otros, los carcinomas epidermoides, adenocarcinomas, y carcinomas macrocíticos, y que representan aproximadamente el 80% de los casos. Los carcinomas epidermoides y los adenocarcinomas son los cánceres más extendidos.

Hoy en día, el diagnóstico del carcinoma broncopulmonar se realiza esencialmente mediante radiografía pulmonar y escáner torácico. Una endoscopia bronquial que permite la realización de biopsias confirma a continuación el diagnóstico. Por desgracia, los síntomas evocadores son desafortunadamente tardíos y poco específicos, y el diagnóstico interviene de forma tardía, reduciendo de este modo en gran medida la eficacia y la factibilidad de los tratamientos existentes. Además, este tipo de diagnóstico requiere un material eficaz y personal cualificado, lo que es costoso.

Actualmente están disponibles diferentes métodos de tratamiento: cirugía, quimioterapia, radioterapia. Estos tratamientos pueden realizarse, de manera aislada, o de manera secuencial o combinada.

La tasa de supervivencia del cáncer de pulmón depende en gran medida del grado de diseminación del tumor en el momento del diagnóstico. La tasa global de supervivencia a 5 años es del orden del 15%. Esta tasa enmascara sin embargo disparidades importantes. La tasa de supervivencia de los pacientes que tienen un cáncer metastatizado a distancia durante el diagnóstico es inferior al 5%, mientras que los pacientes cuyo carcinoma "no microcítico" (CBNM) está localizado en el momento de su descubrimiento presentan tasas de supervivencia próximas al 50%¹. Estos últimos son tratados esencialmente mediante resección quirúrgica del tumor, enfoque que, por el momento, representa la única solución curativa para este tipo de cáncer. Sin embargo, menos de un paciente de cada 3 puede ser objeto de dicho tratamiento y un paciente de cada 2 tratados mediante cirugía fallece en los meses siguientes a la operación, después de una recidiva tumoral. Los avances recientes en el campo de la quimioterapia moderna del CBNM permiten prever tratamientos adyuvantes o neo-adyuvantes que mejoran la esperanza de vida de los pacientes operados². Dichos tratamientos no son, sin embargo, anodinos con una tasa de mortalidad asociada no despreciable. En este contexto, es importante poder identificar a los pacientes operables que presentan un alto riesgo de muerte por recidiva, para facilitar la decisión de aplicar o no una quimioterapia neo-adyuvante o adyuvante.

Desde hace años se investigan y estudian marcadores que permitan distinguir las células tumorales de las células sanas para todos los cánceres y particularmente del carcinoma broncopulmonar. Estos permitirían diagnosticar precozmente la enfermedad, establecer su pronóstico y su sensibilidad al tratamiento, y supervisar su evolución. En los últimos años, más de 100 candidatos se han sugerido como marcadores moleculares de diagnóstico del carcinoma broncopulmonar. Los estudios han previsto de este modo, el papel de diagnóstico de proto-oncogenes, de factores implicados en el ciclo celular, apoptosis o angiogénesis. Sin embargo, pocas correlaciones entre los resultados obtenidos mediante diferentes técnicas y de validaciones entre diferentes cohortes de pacientes pudieron obtenerse de acuerdo con la técnica empleada (inmunohistoquímica, dosificación inmunológica, chips de ADN que utilizan diferentes algoritmos) y la gran diversidad de tumores (tipo histológico, estadio, grado de diferenciación).

Otros marcadores, que pertenecen a una sub-familia de serina proteasas, las kalicreínas, de las que se enumeran 15, también se han ensayado. De este modo, en un estudio con chips de ADN, el gen hKLK11 se ha identificado como marcador de los adenocarcinomas endocrinos de tipo C2³. Un estudio similar mostró que los genes hKLK5 y hKLK10 se sobre-expresan en los carcinomas epidermoides⁴. Del mismo modo, se ha mostrado que los genes hKLK5 et hKLK7, que codifican respectivamente las proteínas hK5 y hK7, estaban sobre-expresados en los tejidos tumorales de carcinomas epidermoides, mientras que una sub-expresión del gen hKLK7 en los tejidos tumorales se observa generalmente en los pacientes que presentan un adenocarcinoma⁵. Sin embargo, no se ha podido establecer ningún vínculo entre la expresión diferencial de estos genes hKLK y un pronóstico vital para los pacientes aquejados de un carcinoma broncopulmonar.

Los genes de las 15 kalicreínas presentan características comunes, entre ellas la presencia de varios transcritos para el mismo gen. Los transcritos de estos genes también se han estudiado como marcadores. De este modo, se ha indicado que tres transcritos alternativos de los genes hKLK4⁶, hKLK5⁷, un transcrito del gen hKLK7⁷ estaban sobre-expresados en tumores y/o en líneas celulares ováricas comparativamente al tejido no canceroso.

Se conoce que el perfil de expresión del gen hKLK8 da lugar a al menos 4 transcritos diferentes, llamados NT1 a NT4. El transcrito NT1 o "neuropsina de tipo 1", identificada por Yoshida S. et al⁸, codifica una preproenzima de 260 aminoácidos que contiene un péptido señal de secreción de 28 aminoácidos y un prosegmento muy corto de 4 restos que debe escindirse para liberar la forma activa de la kalicreína 8. El NT1 está considerado como la forma regular de expresión del gen. El transcrito NT2 o "neuropsina-T2", identificado por Mitsui S. et al⁹, se diferencia de la forma NT1 por la inserción de una secuencia que codifica 45 aminoácidos suplementarios en la región carboxi-terminal del péptido señal. Los transcritos NT3 y NT4 fueron identificados por Magklara A. et al¹⁰ y codifican proteínas que contienen respectivamente 119 y 32 restos. La forma proteica predicha a partir de NT3 solamente posee una parte del péptido señal de kalicreína 8 y no conserva la zona de escisión de éste. La proteína predicha a partir de NT4 está constituida por los 23 primeros restos del péptido señal de kalicreína 8 y por 9 restos suplementarios sin identidad con kalicreína 8. Magklara A. et al¹⁰ mostraron que, aunque la forma regular de expresión del gen KLK8, NT1, tenga un valor de pronóstico en el marco del cáncer de ovario, las formas NT3 y NT4 no tienen ningún valor.

Los Solicitantes han demostrado ahora de forma sorprendente que los transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8 que codifica kalicreína 8, seleccionados entre NT3 y NT4, en una tasa elevada, eran un buen marcador de diagnóstico, y particularmente de pronóstico desfavorable, en el marco de los carcinomas broncopulmonares, y en particular de los carcinomas bronquiales no microcíticos.

De este modo, la presente invención...

1. Procedimiento de diagnóstico in vitro de carcinoma broncopulmonar, particularmente de carcinoma bronquial no microcítico, caracterizado porque comprende la etapa de detección, en una muestra biológica procedente de un paciente sospechoso de estar aquejado de dicho carcinoma broncopulmonar, de al menos uno de los transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8 que codifica kalicreína 8.

2. Procedimiento de pronóstico in vitro de carcinoma broncopulmonar, particularmente de carcinoma bronquial no microcítico, caracterizado porque comprende la etapa de detección, en una muestra biológica procedente de un paciente sospechoso de estar aquejado de dicho carcinoma broncopulmonar, de al menos uno de los transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8 que codifica kalicreína 8.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los transcritos mayoritarios alternativos del gen 1 KLK8 se seleccionan entre los transcritos NT3 y NT4.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 ó 3, caracterizado porque emplea las etapas que consisten en:

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 ó 3, caracterizado porque comprende también la etapa de detección de al menos otro transcrito del gen KLK8.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el al menos otro transcrito del gen KLK8 es el transcrito que codifica kalicreína KLK8, también llamado NT1.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el al menos otro transcrito del gen KLK8 es un transcrito alternativo.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el o los transcritos alternativos se seleccionan entre NT2, NT3, NT4, NT5 y NT6.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado porque emplea las etapas que consisten en:

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 ó 5, caracterizado porque comprende también la etapa de detección de al menos un transcrito de un gen que codifica otra kalicreína.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque emplea las etapas que consisten en:

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 ó 3, caracterizado porque comprende también la etapa de detección de al menos un transcrito de otro gen que se expresa en el pulmón, gen que no codifica una kalicreína.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque emplea las etapas que consisten en:

14. Utilización de un kit de diagnóstico que comprende socios de unión de los transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8, preferentemente sondas nucleicas o cebadores de amplificación, para la realización del procedimiento tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 12.

15. Transcrito NT5 alternativo del gen KLK8 que codifica kalicreína 8, caracterizado porque tiene la secuencia SEC ID Nº 7.

16. Transcrito NT6 alternativo del gen KLK8 que codifica kalicreína 8, caracterizado porque tiene la secuencia SEC ID Nº 8.