COMPUESTOS HIBRIDOS TRIPIRROL-OCTAARGININA.

Compuestos híbridos tripirrol-octaarginina.

Híbridos formados por un grupo tripirrol unido a un péptido de poliarginina que permiten la internalización celular eficiente y promueve una mayor afinidad por el ADN.

Su método de obtención y sus usos

Compuestos híbridos tripirrol-octaarginina.

La presente invención se refiere a un compuesto formado por un grupo tripirrol unido a un péptido de poliarginina. Además, se refiere a su método de obtención y sus usos, puesto que dicho compuesto permite la internalización celular eficiente y promueve una mayor afinidad por el ADN.

Estado de la técnica anterior

Una de las estrategias moleculares de mayor interés para el desarrollo de agentes antibióticos o antitumorales se basa en la interacción de determinadas moléculas con zonas específicas del ADN (L. Strekowski, Mutation Res. 2007, 623, 3-13)

Algunas de estas moléculas se encuentran en fase de ensayo clínico, y otras, como las antraciclinas o la bleomicina, ya se vienen utilizando en clínica desde hace años.

La mayoría de los DNA minor groove-binding ligands (MGBLs) presentan dificultad para atravesar las membranas celulares y alcanzar de forma eficiente el núcleo celular. Así, por ejemplo, poliamidas basadas en el antibiótico Distamicina A, a pesar de que son capaces de interaccionar con secuencias específicas del ADN, experimentan procesos de internalización celular muy lentos, y dependientes de su estructura. (N.G. Nickols, C.S. Jacobs, M.E. Farkas, P.B. Dervan, Nucleic Acids Res. 2007, 35, 363-370; Edelson, T.P. Best, B. Olenyuk, N.G. Nickols, R.M. Doss, S. Foister, A. Heckel, P.B. Dervan, Nucleic Acids Res. 2004, 32, 2802-281)).

En este sentido algunos documentos del estado de la técnica, por ejemplo la solicitud de patente WO2008043366, que se refieren a compuestos para el transporte de agentes biológicos a través de membrana. Algunos de estos compuestos son péptidos cationicos.

Explicación de la invención

La presente invención pretende solucionar el problema de la dificultad de ciertos agentes que interaccionan con ADN en atravesar las membranas celulares y alcanzar de forma rápida el núcleo celular, así como mejorar la interacción con el ADN sin pérdida de selectividad. Para ello, la presente invención se refiere a la conjugación de un elemento de reconocimiento del surco menor del ADN de tipo tripirrólico con fragmentos de poliarginina con el fin de obtener agentes que interaccionan con ADN "in vivo" de forma rápida y eficiente (Fig. 1).

Con el fin de estudiar relaciones estructura-función se prepararon una serie de híbridos péptido-tripirrol, así como controles sin el tripirrol y sin el péptido de poliarginina, y se incorporó un grupo fluoróforo en las moléculas para poder realizar el seguimiento del proceso de internalización celular mediante análisis con un microscopio de fluorescencia. Los ensayos de internalización se realizaron en células HeLa vivas.

Los resultados, que se aportan en el apartado de ejemplos, demuestran como la conjugación de un tripirrol a octaargininas permiten una internalización celular eficiente y una localización muy rápida en el núcleo celular. La presencia de la región peptídica básica provoca un aumento muy destacable en la afinidad del sistema por secuencias de ADN ricas en adeninas (más de 100 veces con respecto al tripirrol solo). El funcionamiento de estos conjugados se fundamenta en la sinergia entre el elemento de reconocimiento específico (tripirrol) y el fragmento peptídico, que no solo facilita el transporte celular sino que también promueve una mayor afinidad por el ADN.

Por todo ello, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un elemento de reconocimiento del surco menor del ADN de tipo tripirrólico unido a un péptido poliarginina, más concretamente la octaarginina ((Arg)₈). Esta unión se produce por medio de un grupo espaciador que comprende, al menos, una lisina (Lys) por la que se une el tripirrol. (A partir de ahora los denominaremos compuestos de la invención).

Como elemento de reconocimiento del surco menor del ADN ó ligandos del surco menor del ADN (DNA minor groove-binding ligands ó MGBLs) se conocen una serie de compuestos que exhiben una serie de propiedades antitumorales, antimicrobianas, antivirales y antiprotozoo. Se conoce que las estructuras que contienen un imidazol y un pirrol, del tipo de la poliamida heterocíclica Distamicina pueden unirse al surco menor de la doble hélice, preferentemente en zonas ricas en AT, aumentando la torsión de la doble hélice, induciendo un superenrollamiento positivo e interfiriendo tanto en la replicación como en la transcripción. La unión al ADN se debe en parte a que los hidrógenos amida de las N-metilpirrolcarboxamidas forman puentes de hidrógeno bifurcados con los átomos N₃ de la adenina y O₂ de la timidina en el surco menor (Koopka et al., 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1376; Koopka et al., 1985. J. Mol. Biol. 183:553). Los anillos de pirrol llenan completamente el surco, excluyendo el grupo amino de la guanina de los pares de bases G,C, mientras establecen fuerzas de van der Waals con las paredes del surco, mostrando afinidad por las secuencias ricas en A y T (Taylor et al., 1985. Tetrahedron 40:457; Schultz & Dervan. 1984. J. Biomol. Struct. Dyn. 1:1133).

Con el fin de estudiar la internalización y la unión de este complejo con el ADN, se unió a un grupo fluoróforo, por lo que en una realización preferida de la invención, este compuesto puede estar unido a su vez a un grupo fluoróforo, preferiblemente fluoresceína (Flu).

En otra realización preferida de la presente invención, el tripirrol presenta la fórmula general (I):

Donde, R₁ es un sustituyente que puede ser igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de la lista que comprende H, un grupo alquilo (C₁-C₆) o un grupo acilo; R₂ es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (IIA):

o de fórmula general (IIB):

Donde R₁ se define como anteriormente y n toma valores entre 1 y 6, preferiblemente 3, 4 y 5, y R₄ es un sustituyente que puede ser igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de la lista que comprende H, o un grupo alquilo (C₁-C₆), preferentemente un metilo.

R₃ es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (III):

Donde R₁ y n se definen como anteriormente.

En una realización aún más preferida, R₁ es igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de la lista que comprende H, un grupo alquilo (C₁-C₃), preferiblemente metilo o un grupo acetilo. Más preferiblemente el compuesto tripirrolico es el siguiente:

Donde representa el sitio de unión con la lisina del espaciador.

El término "alquilo" citado como sustituyente de R₁ se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 6 átomos de carbono. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 3 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo o n-propilo.

En cuanto al espaciador de la presente invención, se trata de una estructura compuesta por al menos un aminoácido lisina (Lys), al que se unirá el tripirrol y grupos ácido 6-aminohexanoico (Ahx), donde se unirá el péptido y/o el fluoróforo en caso de que este se incluya.

En una realización preferida, el espaciador es del tipo (Lys-Ahx) o (Ahx-Lys-Ahx), esta última presentaría la siguiente fórmula (IV):

En una realización más preferida, el compuesto es el de fórmula 6A o cualquiera de sus sales o isómeros:

En otra realización más preferida, el compuesto es el de fórmula 1A o cualquiera...

1. Compuesto que comprende un grupo tripirrol unido a una octaarginina ((Arg)₈) por medio de un espaciador que comprende, al menos, una lisina (Lys).

2. Compuesto según la reivindicación 1 que además comprende un grupo fluoróforo.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el tripirrol presenta la fórmula (1):

R₁ es igual o diferente y se selecciona independientemente de la lista que comprende H, un grupo alquilo (C₁-C₆) o un grupo acilo;

R₂ es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (IIA):

ó de fórmula general (IIB):

R₃ es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (III):

donde n toma valores entre 1 y 6.

4. Compuesto según la reivindicación 3 donde el tripirrol es:

donde representa el sitio de unión con la lisina del espaciador.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el espaciador además de la lisina comprende ácido 6-aminohexanoico (Ahx).

6. Compuesto según la reivindicación 5 donde el espaciador presenta la fórmula (Ahx-Lys-Ahx):

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 donde el fluoróforo es fluoresceína.

8. Método de obtención de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende los siguientes pasos: