Un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende:

(a) centrifugación a baja velocidad de una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y (b) recuperación del virus de la primera capa

Composiciones que comprenden virus y procedimientos para concentrar preparaciones virales.

I. Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden virus, especialmente vectores virales, que tienen estabilidad significativamente mejorada. Las composiciones descritas en este documento son útiles para mantener la estabilidad de virus durante el almacenamiento, y las composiciones que contienen virus descritas en este documento son particularmente útiles para usos terapéuticos tales como terapia génica. También se proporcionan nuevos procedimientos para concentrar y purificar preparaciones virales.

II. Antecedentes

Los virus se han hecho importantes de forma creciente para usos terapéuticos, tales como vacunaciones y terapia génica, y existe la necesidad de desarrollar y preparar composiciones que contienen virus estables que puedan almacenarse y transportarse fácilmente, reteniendo aún suficiente seguridad y eficacia. En particular, dado el uso extensivo de los vectores virales en terapia génica, es importante desarrollar y preparar una formulación que pueda conservar de forma estable virus recombinantes vivos cuando llevan transgenes terapéuticos.

Además, existe la necesidad crítica de formulaciones que puedan estabilizar preparaciones virales a temperaturas por encima de -80ºC durante periodos prolongados de tiempo. Las composiciones que contienen virus normalmente requieren almacenamiento a -80ºC y no pueden almacenarse a temperaturas de refrigeración convencionales (por ejemplo, de 2ºC a 8ºC, o mayores) durante periodos sustanciales de tiempo. Esta limitación representa un serio impedimento no solamente para el almacenamiento, sino también para el procesamiento, distribución, y uso clínico extendido.

También existe la necesidad de desarrollar composiciones que contienen virus que pueden mantener el pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 durante periodos prolongados a pesar de exponerse a temperaturas de refrigeración, y a pesar de someterse a condiciones duras tales como congelación/descongelación, especialmente las lentas velocidades de congelación/descongelación que pueden existir en conexión con producción, manipulación, o distribución a mayor escala. El mantenimiento del pH es importante para las preparaciones virales porque a pH por debajo de 7,0 y por encima de 8,5 las partículas de virus vivo son vulnerables a la pérdida de viabilidad debido a la inestabilidad física y biológica.

Los problemas adicionales se refieren a concentraciones crecientes de virus. En particular, una concentración elevada de virus contribuye significativamente a la inestabilidad del virus. Sin embargo, son necesarias concentraciones crecientemente mayores de virus y vectores virales para uso terapéutico. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar formulaciones que estabilicen concentraciones relativamente elevadas de virus, especialmente en las duras condiciones mencionadas anteriormente. Y además, existe una necesidad particular de desarrollar nuevos procedimientos para concentrar una preparación de virus existente para conseguir preparaciones estables a niveles de concentración mayores. Los problemas de inestabilidad asociados con concentraciones mayores de virus se exacerban significativamente si se intenta concentrar una preparación de virus existente. Esto se debe en parte a las fuerzas mecánicas de cizalla adicionales que tiene que soportar durante los esfuerzos para aumentar la concentración de una preparación de virus existente. Si se pudiera encontrar un procedimiento para concentrar una preparación de virus sin alteración sustancial a la estabilidad del virus, entonces podrían prepararse fácilmente dosificaciones clínicas a cualquier concentración deseada (incluso cuando se parte de material que tiene una concentración inferior) y, de forma importante, la capacidad de concentrar el virus podría eliminar los atascos problemáticos y otros problemas del aumento en escala durante el procedimiento de purificación permitiendo un rendimiento significativamente mayor durante diversas etapas de procesamiento tales como cromatografía por exclusión de tamaño.

Por tanto existe la necesidad de materiales y procedimientos para conseguir los objetivos anteriores.

III. Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende: (a) centrifugación a baja velocidad de una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y (b) recuperación del virus de la primera capa. Preferiblemente, el virus es un virus recombinante, que lleva opcionalmente un transgén terapéutico para su uso en terapia génica. Preferiblemente, el virus es adenovirus, preferiblemente A/C/N/53. El polihidroxi hidrocarburo es preferiblemente glicerol.

Se describe en este documento una composición estable que comprende virus en una formulación que comprende un polihidroxi hidrocarburo tamponado para mantener un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC.

Se proporcionan nuevos procedimientos para concentrar una preparación de virus existente que permitan seleccionar y preparar fácilmente dosificaciones clínicas en un amplio intervalo de concentraciones deseadas. Un procedimiento descrito para concentrar una preparación de virus comprende:

(a) añadir un polihidroxi hidrocarburo a una preparación de virus a una concentración final de polihidroxi hidrocarburo de aproximadamente el 20% o más; y

(b) someter la preparación de virus a un procedimiento de filtración en el que se aumenta la concentración de virus aplicando presión a la preparación de modo que se elimine el diluyente de la preparación de virus a través de un filtro al tiempo que se retiene el virus.

También se describe en este documento un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende:

(a) centrifugar una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y

(b) recuperar el virus de la primera capa.

Además, los presentes inventores descubrieron que su nuevo procedimiento de aumentar la concentración de virus tiene la ventaja adicional de potenciar el procesamiento adicional (por ejemplo, reduciendo o eliminando los atascos problemáticos durante la posterior purificación permitiendo un rendimiento significativamente mayor durante las etapas de procesamiento tales como cromatografía por exclusión de tamaño). Por tanto, en una realización preferida, el procedimiento para concentrar las preparaciones de virus de acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente una etapa de purificación posterior (por ejemplo, cromatografía por exclusión de tamaño). A este respecto, el procedimiento de la presente invención es particularmente útil cuando se realiza cromatografía por exclusión de tamaño posterior a cromatografía de intercambio iónico, y se concentra la preparación de virus (de acuerdo con la presente invención) después de la cromatografía de intercambio iónico pero antes de la cromatografía por exclusión de tamaño. Las fracciones virales obtenidas de una cromatografía de intercambio aniónico, por ejemplo, típicamente contienen elevados niveles de sales y posiblemente otras impurezas que comprometen adicionalmente la estabilidad del virus durante los procedimientos de concentración. Se describe en este documento un procedimiento para purificar una preparación de virus que comprende:

(a) someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el virus se eluye en forma de un producto de preparación de virus de un medio de cromatografía de intercambio aniónico;

(b) añadir un polihidroxi hidrocarburo al productor de preparación de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de polihidroxi hidrocarburo en la preparación...

1. Un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende:

(a) centrifugación a baja velocidad de una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y

(b) recuperación del virus de la primera capa.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus es un virus recombinante.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus es un virus recombinante que lleva un transgén a terapéutico para su uso en terapia génica.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polihidroxi hidrocarburo es glicerol.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus es adenovirus.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el virus recombinante es A/C/N/53.