Chip europeo de cromosoma Y ("Y-European Chip") y procedimiento para el genotipado de Y-SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) que determinan los haplogrupos más frecuentes en Europa mediante chips de ADN.

El procedimiento se basa en la amplificación de los fragmentos que contienen los SNPs de interés y la determinación de la base implicada en el polimorfismo mediante una reacción de minisecuenciación empleando cebadores que en su extremo 5'' portan una cola (tag), para su posterior detección mediante la hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con un microarray constituido por las secuencias complementarias a las colas (cTag)

Chip europeo de cromosoma Y ("Y-European Chip") y procedimiento para el genotipado de Y-SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) que determinan los haplogrupos más frecuentes en Europa mediante chips de ADN.

Sector de la técnica

El procedimiento para el genotipado de SNPs de cromosoma Y que determinan los haplogrupos más frecuentes en poblaciones europeas mediante chips de ADN es de aplicación en genética, y en particular, genética forense y genética de poblaciones.

Estado de la técnica

Los SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) son el tipo de variación genética más frecuente en el genoma humano, e incluyen aquellas posiciones de la cadena del ADN en las cuales dos bases alternativas (alelos) aparecen en alguna población, siendo la frecuencia del alelo menos frecuente igual o mayor al 1%. La mayoría de los SNPs son bialélicos, aunque también existen SNPs con tres y cuatro alelos en un porcentaje mucho menor. Dependiendo de la región en la que se encuentre el SNP, el polimorfismo puede tener distintas consecuencias. Cuando el SNP está situado en la región codificante de un gen, la función o estructura de la proteína codificada puede verse alterada teniendo consecuencias clínicas, bien provocando enfermedades o bien alterando la eficacia de los tratamientos, y por lo tanto la detección de la base polimórfica es importante para el diagnóstico genético y la farmacogenética.

Cuando los SNPs están situados en regiones reguladoras de genes también pueden afectar a la función génica. Sin embargo, la mayoría de los SNPs están situados en regiones no codificantes del genoma y no afectan directamente al fenotipo de un individuo. En este caso son marcadores muy útiles en genética de poblaciones, evolutiva (ZHAO Z., et. al Investigating single nucleotide polymorphism (SNP) density in the human genome and its implications for molecular evolution. Gene 2003, Vol 312, páginas 207-213.), y forense (GILL P. An assessment of the utility of single nucleotide polymorphisms for forensic purposes. Int J Legal Med 2001, Vol 114, pág 204-210.). La principal razón del creciente interés en los SNPs es la esperanza de que puedan ser usados como marcadores para identificar genes de predisposición a enfermedades complejas mediante desequilibrio de ligamiento (RISCH N.,et. al The future of genetic studies of complex human diseases. Science. 1996 Vol 273, pág 1516-1517; SCHORK N.J., et. al. The future of genetic epidemiology. Trends Genet. 1998, Vol 14, Nº 7, pág 266-272).

Las características que hacen a este tipo de polimorfismos tan atractivos para aplicaciones tan diversas son su elevada frecuencia en el genoma, estimándose que existe una base polimórfica por cada 500-1000 bases de ADN, aproximadamente (SACHIDANANDAM R., et. al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature 2001, Vol 409, páginas 928-933; VENTER J.C., et. al. The sequence of the human genome. Science 2001 Vol 291, páginas 1304-51); su baja tasa de mutación, lo que los convierte en marcadores muy estables que no tienden a cambiar de generación en generación; y su simplicidad y en consecuencia la posible automatización de su análisis.

Desde la publicación del borrador del Proyecto Genoma Humano, en febrero del 2001, han sido descritos una gran cantidad de SNPs. En la actualidad existen diversas bases de datos, tanto públicas como privadas, que recogen la información de todos los SNPs descubiertos hasta el momento y que se van actualizando continuamente. Las principales bases de datos son: NCBI dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), The SNP Consortium (http://snp.cshl.org), Ensembl (http://www.ensembl.org/Homosapiens/), HGVBase (http://hgvbase.cgb.ki.se/) y Celera (http://www.celeradiscovery system.com/).

Todos los marcadores polimórficos situados en el cromosoma Y resultan de gran interés en genética forense, así como en el estudio de las poblaciones humanas, debido a que dicho cromosoma presenta una herencia paterna y a que, en su gran mayoría, es haploide. La falta de recombinación en la mayor parte del cromosoma Y ha hecho que éste se comporte como un fragmento único de ADN portador de un haplotipo (haplogrupo si los marcadores que estamos analizando son SNPs), que se transmite intacto de padres a hijos, a no ser que ocurra algún evento mutacional. De esta manera, cada cromosoma Y contiene una grabación de todos los eventos mutacionales ocurridos a lo largo de su historia y posibilita la reconstrucción de linajes paternos de los cromosomas Y actuales con el fin de encontrar un ancestro común (JOBLING M.A, TYLER-SMITH C. Fathers and sons: the Y chromosome and human evolution. Trends Genet. 1995 Vol, 11, Nº 11, páginas 449-456).

La especificidad masculina y la herencia sin recombinación hacen que el cromosoma Y tenga también un alto interés en genética forense. Resulta muy útil en casos de paternidad en los que el presunto padre está ausente y los hijos son varones, teniendo en cuenta que no es posible excluir a ningún otro varón de la línea paterna. En criminalística se aplica fundamentalmente en casos de agresión sexual ya que permite discriminar el ADN masculino en las posibles mezclas hombre-mujer.

Los marcadores genéticos utilizados en genética forense en la actualidad son los STRs (Short Tandem Repeats), aunque en los últimos años el interés por los SNPs ha ido en aumento debido principalmente a su abundancia, su baja tasa de mutación (THOMSON R., et. al Recent common ancestry of human Y chromosomes: evidence from DNA sequence data. Proc Natl Acad Sci USA. 2000, Vol 97, Nº 13, páginas 7360-7365) y su simplicidad. Esta última característica es de gran importancia ya que por un lado nos permite analizar fragmentos de ADN más pequeños que con los STRs, posibilitando el análisis de muestras degradadas, muy frecuentes en los laboratorios de genética forense. Por otro lado, permite la automatización del análisis, lo cual es imprescindible ya que el número de SNPs que es necesario analizar es más elevado que en el caso de los STRs, debido a que son mucho menos polimórficos.

A finales de la década de los 90 había descritos unos 40 polimorfismos bialélicos en el cromosoma Y (UNDERHILL P.A., et. al. Detection of numerous Y chromosome biallelic polymorphisms by denaturing high-performance liquid chromatography. Genome Res. 1997, Vol 7, Nº 10, páginas 996-1005; HURLES M.E., et. al. European Y-chromosomal lineages in Polynesians: a contrast to the population structure revealed by mtDNA. Am J Hum Genet. 1998, Vol 63, Nº 6, páginas 1793-1806). En enero de12004la base de datos Ensembl (underbar{http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/}) presentaba 36449 Y-SNPs, aunque la mayoría de ellos pueden ser consecuencia de secuencias parálogas (JOBLING M.A., TYLER-SMITH C. The human Y chromosome: an evolutionary marker comes of age. Nat Rev Genet. 2003, Vol 4, Nº 8, páginas 598-612; SANCHEZ J.J., et. al. Duplications of the Y-chromosome specific loci P25 and 92R7 and forensic implications. Forensic Sci Int. 2004, Vol 140, Nº 2-3, páginas 241-250). En la actualidad hay más de, 240 SNPs de cromosoma Y bien caracterizados. Uno de los principales problemas que había hasta hace muy poco, a la hora de trabajar con los SNPs de cromosoma Y, es que no existía una nomenclatura unificada para los haplogrupos del cromosoma Y. Este problema fue solucionado por el Y Chromosome Consortium (Y Chromosome Consortium. A Nomenclature system for the tree of human Y-chromosomal binary haplogroups. Genome Res. 2002, Vol 12, páginas 339-348), sen- tando las bases incluso para la incorporación de nuevos haplogrupos que se puedan ir incorporando a los ya descritos.

Los haplogrupos del cromosoma Y no se encuentran distribuidos uniformemente en todas las poblaciones humanas sino que presentan una clara diferenciación geográfica (SEIELSTAD M.T., et. al. Genetic evidence for a higher female migration rate in humans. Nature Genet 1998, Vol 20, páginas 278-280). Como consecuencia, dependiendo de la región del mundo que se esté estudiando, nos encontraremos con unos haplogrupos u otros (ROSSER Z., et. al. Y chromosomal diversity within Europe is clinal and influenced primarily by geography, rather than language. Am J Hum Genet 2000, Vol 67, páginas 1526-1543; KARAFET T.M., et. al. Ancestral Asian source(s) of New World Y-chromosome founder haplotypes. Am J Hum Genet 1999, Vol 64, páginas 817-831). Esta especificidad geográfica de los distintos haplogrupos de cromosoma Y, puede ser una herramienta muy útil en forense a la hora de...

1. Procedimiento para el genotipado de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) de cromosoma Y que determinan los haplogrupos más frecuentes en poblaciones europeas mediante chips de ADN, caracterizado por la amplificación de los fragmentos que contienen los SNPs de interés, y la determinación de la base implicada en el polimorfismo mediante una reacción de minisecuenciación empleando primers o cebadores que portan una cola (tag), para su posterior detección mediante la hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con un microarray constituido por las secuencias complementarias a las colas (cTag), procedimiento que consta de las siguientes etapas:

2. Procedimiento para el genotipado de SNPs, según la reivindicación 1, caracterizado por la fabricación de microarrays constituidos por las cTags, Sec ID Nº 1-29, que son oligonucleótidos complementarios a las colas que portan los cebadores de minisecuenciación en su extremo 5' y que se encuentran unidas al soporte sobre el que se fabrica el microarray por el extremo 3'.

3. Procedimiento para el genotipado de SNPs, según la reivindicación 1, caracterizado por la amplificación de los 30 SNPs seleccionados, para determinar los haplogrupos más frecuentes en Europa, y que son los SNPs: 92R7, Tat, P25, SRY₁₀₈₃₁, 12f2, M9, M17, M18, M22, M26, M34, M35, M37, M62, M65, M70, M73, M78, M81, M96, M123, M126, M153, M160, M167, M170, M172, M173, M201, M213.

4. Procedimiento para el genotipado de SNPs, según la reivindicación 1, caracterizado por la reacción de minisecuenciación o single base extension (SBE) . utilizando los cebadores de minisecuenciación que finalizan en su extremo 3' en la base anterior a la posición polimórfica y en el extremo 5' portan una cola o tag complementaria a la cTag correspondiente y cuyas secuencias se corresponden con los siguientes identificadores: 92R7 (SEC. ID. Nº: 30 + SEC. ID. Nº: 59), M70 (SEC. ID. Nº: 31 + SEC. ID. Nº: 60), M22 (SEC. ID. Nº: 32 + SEC. ID. Nº: 61), Tat (SEC. ID. Nº: 33 + SEC. ID. Nº: 62), P25 (SEC. ID. Nº: 34 + SEC. ID.: Nº: 63), SRY₁₀₈₃₁ (SEC. ID. Nº: 35 + SEC. ID. Nº: 64), M173 (SEC. ID. Nº: 36 + SEC. ID. Nº: 65), M213 (SEC. ID. Nº: 37 + SEC. ID. Nº: 66), M9 (SEC. ID. Nº: 38 + SEC. ID. Nº: 67), M201 (SEC. ID. Nº: 39 + SEC. ID. Nº: 68), M26 (SEC. ID. Nº: 40 + SEC. ID. Nº: 69), M170 (SEC. ID. Nº: 41 + SEC. ID. Nº: 70), M172 (SEC. ID. Nº: 42 + SEC. ID. Nº: 71), M62 (SEC. ID. Nº: 43 + SEC. ID. Nº: 72), M96 (SEC. ID. Nº: 44 + SEC. ID. Nº: 73), M34 (SEC. ID. Nº: 45 + SEC. ID. Nº: 74), M81 (SEC. ID. Nº: 46 + SEC. ID. Nº: 75), M35 (SEC. ID. Nº: 47 + SEC. ID. Nº: 76), M123 (SEC. ID. Nº: 48 + SEC. ID. Nº: 77), M78 (SEC. ID. Nº: 49 + SEC. ID. Nº: 78), M65 (SEC. ID. Nº: 50 + SEC. ID. Nº: 79), M126 (SEC. ID. Nº: 51 + SEC. ID. Nº: 80), M73 (SEC. ID. Nº: 52 + SEC. ID. Nº: 81), M160 (SEC. ID. Nº: 53 + SEC. ID. Nº: 82), M37 (SEC. ID. Nº: 54 + SEC. ID. Nº: 83), M167 (SEC. ID. Nº: 55 + SEC. ID. Nº: 84), M17 (SEC. ID. Nº: 56 + SEC. ID. Nº: 85), M18 (SEC. ID. Nº: 57 + SEC. ID. Nº: 86), M153 (SEC. ID. Nº: 58 + SEC. ID. Nº: 87).

5. Uso de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para casos de agresiones sexuales.