DETERMINACIÓN DEL GRADO DE METILACIÓN DE ADN.

La invención se encuentra dentro del campo de la epigenética, especialmente de la metilación de ADN. Proporciona un procedimiento de amplificación para la detección de modificaciones epigenéticas que son relevantes para el diagnóstico clínico. Además se proporcionan cebadores específicos para este procedimiento de amplificación. Los mecanismos epigenéticos provocan modificaciones de la expresión génica, que no van acompañadas de una modificación de la secuencia codificante de los genes, sin embargo por ejemplo pueden transmitirse de manera mitótica. Los patrones de metilación de ADN se transmiten de manera acoplada a la replicación de la célula madre a las células hijas. Por consiguiente se garantiza la transmisión hereditaria de la información epigenética. En eucariotas superiores, la metilación de ADN representa, junto al silenciamiento asociado a ARN y la modificación de histonas, el mecanismo epigenético mejor estudiado (Serman et al., Coll Antropol. 2006; 30(3):665-71). El genoma humano tiene en una célula sana diferenciada un patrón de metilación de ADN específico y en gran medida invariable que contribuye de manera y modo decisivo en la expresión génica. Según esto están sin metilar regiones genómicas con función reguladora para la transcripción en muchos casos, mientras que están metiladas secciones genómicas sin actividad transcripcional. La metilación de ADN tiene lugar en los restos de citosina del ácido nucleico y preferentemente en dinucleótidos con una secuencia citosina-guanina (CpG). La modificación de bases más importante en eucariotas es la metilación en la posición 5 de la citosina. En una célula tumoral, que se caracteriza entre otras cosas por una elevada tasa de proliferación, una expresión génica modificada y anomalías cromosómicas, el patrón de metilación genómico es aberrante (Schulz, DNA methylation in urological malignancies. Int J Oncol. 1998; 151-67). En muchas publicaciones pertinentes de esta especialidad se sostiene de manera unánime la opinión de que estas modificaciones epigenéticas albergan un potencial inmenso, relevante de manera diagnóstica y pronóstica, cuya evaluación puede conducir a procedimientos modernos de la detección temprana, pronóstico y seguimiento del cáncer. Dado que, sin embargo, en caso de tejido tumoral se producen anomalías cromosómicas, es decir este tejido en comparación con el tejido sano presenta una dotación genómica distinta, el problema básico consiste en determinar una metilación de ADN aberrante de este tipo no sólo de manera cualitativa, sino también de manera cuantitativa y normalizada. Sólo una determinación de permite una comparación directa de dos muestras de las cuales una presenta posiblemente anomalías cromosómicas. Este objetivo se consigue según la invención mediante el procedimiento según la reivindicación 1, así como mediante los desarrollos y perfeccionamientos ventajosos de las reivindicaciones subordinadas. La presente invención proporciona para resolver estos problemas procedimientos para determinar la metilación de ADN normalizada y procedimientos para determinar el grado de metilación de ADN relativo entre al menos dos muestras. En un primer aspecto se da a conocer un procedimiento para determinar el grado de metilación de ADN normalizado, que comprende las etapas: a) determinar cuantitativamente la presencia de un transposón o fragmento del mismo en un ADN; b) determinar cuantitativamente la existencia de al menos una C metilada diferencial de un dinucleótido CpG del transposón o fragmento del mismo; y c) determinar el grado de metilación de ADN normalizado a través de los valores determinados en las etapas a) y b). Según esto, la presente invención usa la observación sorprendente de que el grado de metilación del transposón distribuido aleatoriamente por todo el genoma puede considerarse como representativo para el grado de metilación de todo el genoma. El principio de la invención se basa en determinar en una primera etapa cuantitativamente la presencia de un transposón (o fragmento del mismo) en una ADN de por ejemplo una muestra y determinar en una etapa adicional cuantitativamente la presencia de al menos una citosina metilada diferencial de un dinucleótido CpG del mismo transposón (o fragmento del mismo) en el mismo ADN. A través de la proporción de los valores determinados puede determinarse entonces un grado de metilación de ADN normalizado que es representativo para todo el genoma. La metilación de ADN es un mecanismo post-replicativo, epigenético, que en eucariotas es de considerable significado para la regulación génica. En caso de eucariotas, la adición de un grupo metilo en el átomo de carbono n.º 5 de la base de pirimidina de la citosina desempeña el papel dominante para la formación de 5-metilcitosina ( 5m C). Esta adición de metilo se cataliza in vivo mediante una transferencia del grupo metilo desde la S- adenosilmetionina (donador de metilo) hasta la citosina (aceptor de metilo) con ayuda de ADN-metilasas (DNMT) y se produce preferentemente en citosinas que se encuentran localizadas en 5 con respecto a una guanina (CpG). En el genoma de vertebrados se produce 5m C exclusivamente en dinucleótidos CpG (Bestor. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet 2000; 2395-2402) y en el genoma humano están metiladas en la mayoría de los casos ambas citosinas del dinucleótido CpG palindrómico. 2   Los dinucleótidos CpG están muy mal representados debido a mecanismos evolutivos y a la tendencia de la metilcitosina a desaminarse de manera espontánea al menos en el genoma de mamíferos con un frecuencia del 0,8 % (el contenido en GC promedio en seres humanos asciende a aproximadamente el 40 %, lo que debería conducir a un frecuencia calculada del dinucleótido CpG del 4 %) y se producen por regla general sólo en islas de CpG de manera acumulada, que con frecuencia se encuentran en los NTR de 5 ó 3 de genes (Gardiner-Garden & Frommer. CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol 1987; 261-282). El origen de esta limitación en zonas no codificantes es probablemente el riesgo elevado de mutaciones puntuales mediante la desaminación de 5m C para dar timina (Laird & Jaenisch. The role of DNA methylation in cancer genetic and epigenetics. Annu Rev Genet 1996; 441-464). Las islas de CpG tienen un tamaño de aproximadamente 500 pb - 4 kb y un elevado contenido en GC de > 55 %. Presentan una frecuencia elevada de diez a veinte veces del dinucleótido 5-CpG-3. Más de tres cuartos de todos los genes humanos (aproximadamente 25.000) presentan islas de CpG en sus regiones de inicio. Generalmente, genes con alta actividad transcripcional se encuentran en las regiones genómicas no metiladas. Por el contrario en regiones metiladas se encuentran genes que no son activos o tienen sólo poca actividad transcripcional. Existe una reticulación de metilación de ADN y condensación de cromatina, dado que generalmente son inactivos los genes en heterocromatina densamente empaquetada. Un empaquetamiento denso de este tipo de la cromatina se inicia mediante la desacetilación y metilación de las histonas H3 y H4, lo que conlleva a una unión más consiste de los nucleosomas en el ADN y por consiguiente resulta una peor accesibilidad del ADN para la maquinaria de transcripción (Jenuwein. Re-SET-ting heterochromatin by histone methyltransferases. Trends Cell Biol 2001; 266-273). La proteína que se une a ADN CpG-metilado, MeCP2, puede reclutar histona-desacetilasas e iniciar la condensación de la cromatina (Razin & Razin. CpG methylation, chromatin structure and gene silencing-a three- way connection. EMBO J. 1998; 4905-4908). También las histona-metilasas pueden llevar sin embargo ADNmetiltransferasas a regiones heterocromáticas y por consiguiente producir allí la metilación de ADN (Tamaru & Selker. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 2001; 277-283). Además la acetilación de histonas conduce probablemente a la desmetilación activa de la respectiva sección génica (Cervoni & Szyf. Demethylase activity is directed by histone acetylation. J. Biol. Chem. 2001; 40778-40787). Según se mencionó anteriormente, las metilaciones de ADN irregulares se transmiten en la mayoría de los casos de manera estable a las células hijas y pueden ser por tanto el origen de enfermedades con frecuencia a nivel de órganos. Especialmente, las células tumorales muestran, por ejemplo, con frecuencia patrones de metilación que se desvían significativamente de los de un tejido sano. Por tanto se considera usar el análisis del grado de metilación para , por ejemplo, aplicaciones diagnósticas. Además se considera también una modificación/corrección dirigida del estado de metilación para el objetivo de la regulación génica. Para el análisis del estado de metilación de ácidos nucleicos,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para determinar el grado de metilación de ADN normalizado que comprende las etapas: a) determinación cuantitativa de la presencia de un transposón o fragmento del mismo en un ADN genómico que comprende la amplificación del ADN no bisulfitado con al menos un par de cebadores, que es específico para un transposón o fragmento del mismo, o amplificación del ADN bisulfitado con al menos un par de cebadores que es específico para un transposón bisulfitado o fragmento del mismo, en el que los cebadores no comprenden ninguna posición metilada diferencial del transposón, realizándose la determinación cuantitativa por medio de PCR en tiempo real para determinar un valor de umbral de ciclo; b) determinación cuantitativa de la existencia de al menos una C metilada diferencial de un dinucleótido CpG dentro del mismo transposón o fragmento del mismo, que comprende la amplificación del ADN bisulfitado con al menos un par de cebadores, que es específico para el transposón o fragmento del mismo y que comprende al menos un cebador, que comprende al menos una posición metilada diferencial del transposón, usándose el mismo ADN que en la etapa a) y realizándose la determinación cuantitativa por medio de PCR en tiempo real para determinar un valor de umbral de ciclo; y c) determinación del grado de metilación de ADN normalizado a través de la proporción de los valores de umbral de ciclo determinados en las etapas a) y b). 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el transposón o fragmento del mismo se selecciona del grupo constituido por un elemento LINE, un elemento LINE-1, un elemento Alu, un elemento HERV y preferentemente la región promotora de un elemento LINE-1. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que ambos cebadores del par de cebadores de la etapa b) comprenden al menos una posición metilada de modo diferencial del transposón. 4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el cebador de la etapa b) comprende 2, 3 ó 4 posiciones metiladas de modo diferencial del transposón. 5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el cebador presenta en su extremo 3 una posición metilada de modo diferencial del transposón. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el al menos un cebador de la etapa b) comprende un oligonucleótido que se selecciona del grupo constituido por SEC ID N.º 3 - 1048. 7. Procedimiento para determinar el grado de metilación de ADN relativo que comprende las etapas: a) determinación del grado de metilación de acuerdo con las etapas a) a c) según la reivindicación 1 para un primer ADN y un segundo ADN; y b) determinación del grado de metilación de ADN relativo a través de la proporción de los grados de metilación determinados para el primer y el segundo ADN. 8. Procedimiento según la reivindicación 7 para diagnosticar una enfermedad que se relaciona con una metilación de ADN modificada, en el que el primer ADN es una muestra de referencia y el segundo ADN procede de una muestra que va a someterse a prueba. 9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la enfermedad es un tumor. 10. Uso al menos de un oligonucleótido seleccionado del grupo constituido por SEC ID N.º 3 - SEC ID N.º 1415, preferentemente SEC ID N.º 3 - 436 y/o SEC ID N.º 1049 - 1227 para determinar el grado de metilación de ADN normalizado según la reivindicación 1. 372   373