Procedimiento para detectar hongos dimórficos seleccionados de Histoplasma capsulatum;

Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis; Penicillium marneffei; Paracoccidioides brasiliensis y un híbrido de los mismos, que comprende:

detectar la hibridación entre una sonda dimórfica y una secuencia de ácido nucleico del espaciador de transcripción interna 2 (ITS2) de un hongo dimórfico en una muestra, en el que la sonda dimórfica tiene una secuencia que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4, y en el que la presencia de la hibridación indica la presencia de un hongo dimórfico en la muestra

Ácidos nucleicos para la identificación de hongos y procedimientos para usarlos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la identificación de hongos, incluyendo procedimientos de identificación de hongos basados en características genéticas únicas, tales como el uso de sondas de ácido nucleico para detectar la presencia e identificar nucleótidos obtenidos de especies y clases de hongos.

Antecedentes de la invención

La incidencia de enfermedades causadas por hongos patógenos y oportunistas ha aumentado a lo largo de la última década. Véase, p. ej., McNeil, M.M., y col., Clin. Infect. Dis. 33:641-47 (2001); Ampel, N.M., y col., Clin. Infect. Dis. 27:1528-30 (1998); National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System report, resumen de datos de enero de 1990 a mayo de 1999, Am. J. Infect. Control 27:520-32 (1999). En seres humanos, estas infecciones fúngicas son especialmente prevalentes en personas con sistemas inmunitarios suprimidos, tales como pacientes VIH positivos y gravemente enfermos. Por ejemplo, Penicillium marneffei es la tercera causa más común de infecciones oportunistas en pacientes con SIDA en Tailandia. Vanittanakom N., Sirisanthana T., Curr. Top. Med. Mycol. 8:35-42 (1997). Además, se ha reconocido que P. chrysogenum y P. citrinum son la causa de la enfermedad humana.

El diagnóstico de infecciones fúngicas es hace normalmente aislando el organismo infeccioso en cultivo, mediante ensayos serológicos o por examen histopatológico del tejido. Véase, p. ej., Hamilton, A.J., Med. Mycol. 36:351-64 (1998). Sin embargo, los hongos patógenos pueden necesitar semanas para crecer y un cultivo positivo puede representar una colonización benigna más que la invasión e infección reales, en especial cuando se aíslan organismos oportunistas. Los ensayos serológicos en una sola muestra de suero para detectar anticuerpo antifúngicos circulando pueden ser poco concluyentes (especialmente en sujetos inmunosuprimidos). La adquisición de sueros pareados de la fase aguda y convaleciente, que es necesaria para un diagnóstico serológico definitivo, requiere de 3 a 4 semanas adicionales antes de poder obtenerse el suero de la fase convaleciente. Morrison C.J., y Lindsley, M.D., en Fungal Pathogenesis: Principles and Clinical Applications (New York: Marcel Dekker Inc., 2001; Calderone R.A., y Cihlar R.L., eds.). Por lo tanto, el examen histopatológico de secciones de tejidos a menudo era el más rápido, y a veces el único procedimiento disponible para diagnosticar la enfermedad fúngica invasiva. Sin embargo, el diagnóstico histopatológico de las infecciones fúngicas se hace a menudo por criterios morfológicos, y los hongos con características morfológicas atípicas pueden ser difíciles de identificar y diagnosticar. Además, los hongos para los cuales se pueden usar diferentes terapias antifúngicas, a menudo parecen morfológicamente similares en secciones de tejidos.

El desarrollo relativamente reciente de la síntesis de ADN automatizada, ha permitido la producción de sondas moleculares con propiedades consistentemente definidas, que pueden dar mayor sensibilidad, especificidad y reproducibilidad en los ensayos. La investigación anterior en la identificación molecular de hongos se ha concentrado típicamente en una sola especie o género de hongo. Véase, p. ej., LoBuglio, K.F., y J.W. Taylor, J. Clin. Microbiol. 33:85-89 (1995); Loffler, J., y col., Med. Mycol. 36:275-79 (1998). Por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.631.132; 5.426.027; 5.635.353; y 5.645.992; y publicación PCT WO 98/50584, describen sondas de ácido nucleico y procedimientos para detectar especies fúngicas, basadas en una determinada región (la región ITS2) del ADNr.

Qin y col. (2001) Abstracts of the Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 41:385, J-838, describen el uso de sondas de ADN específicas de especie, dirigidas a la región espaciadora de transcripción interna 2 (ITS2) para diferenciar P. marneffei de otras especies de Penicillium y de algunos otros hongos médicamente importantes.

El documento WO 99/06596 describe sondas de ácido nucleico dirigidas a la región espaciadora de transcripción interna 2 y a su uso para detectar especies de Candida.

Fujita y col. (1995) J. Clin. Microbiol, 33:4, 962-967, describen un inmunoensayo enzimático en placa de microvaloración para detectar el ADN amplificado por la PCR de especies de Candida.

Elie y col. (1998) J. Clin. Microbiol, 36:11, 3260-3265, describen la identificación de especies de Candida con sondas específicas de especie, dirigidas a la región ITS2 del gen para el ARNr.

El documento US 5955274 describe la detección de aislados fúngicos usando cebadores específicos.

Reiss y col. (1998) Med. Mycol., 36: Suplemento 1, 249-257, describen el diagnóstico molecular y la epidemiología de infecciones fúngicas, incluyendo el uso de sondas de ADN dirigidas a la región ITS2 de las especies de Candida.

White y col. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, San Diego, Academic Press, 315-322, describen la amplificación y secuenciación directa de genes de ADN ribosómicos fúngicos para la filogenética.

El documento US 5558990 describe sondas de ensayo de hibridación dirigidas a la subunidad de ARNr 18S, que distinguen B. dermatitidis y P. brasiliensis de otras especies fúngicas.

Además, algunos procedimientos de identificación molecular de hongos pueden ser muy difíciles o incómodos de llevar a cabo, o requieren un equipamiento especializado y caro. Véase, p. ej., Sandhu, G.S., y col., J. Clin. Microbiol. 35:1894-96 (1997); Sandhu, G.S., y col., J. Clin. Microbiol. 33:2913-19 (1995); y Turenne, C.Y., y col., J. Clin. Microbiol. 37:1846-51 (1999).

Resumen

Se describe un procedimiento para detectar un hongo dimórfico, como se define en las reivindicaciones. Se puede usar cualquier muestra adecuada, incluyendo una muestra biológica (p. ej., sangre, esputo, lavado broncoalveolar o tejido de biopsia), y el ácido nucleico se puede amplificar dentro de la muestra, tal como por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En realizaciones particulares, se detecta e identifica el ácido nucleico mediante reacción en cadena de la polimerasa-inmunoensayo enzimático (PCR-EIA). La presencia del ácido nucleico indica que la muestra estuvo en contacto con el hongo, tal como las muestras que contienen actualmente el hongo. Los hongos dimórficos incluyen, pero no se limitan a Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis y Penicillium marneffei.

Si se usa la PCR para amplificar el ácido nucleico en la muestra, se puede usar un cebador ITS1 o ITS4 (listado en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2). Aunque se puede usar la secuencia de ITS3 (SEQ ID NO: 3) como sonda, ITS3 también se puede usar como un cebador para la PCR para amplificar la región ITS2.

Se puede preparar una muestra procesando y extrayendo ácidos nucleicos de una muestra. En algunas realizaciones, se usa una técnica de extracción de ARN de alto rendimiento para extraer el ADN de células fúngicas. En realizaciones particulares, se puede usar una mezcla de varios tipos de microesferas de vidrio diferenciadas por tamaño (p. ej., diámetros de aproximadamente 106 µm, aproximadamente 0,5 mm y aproximadamente 3 mm) o diferenciadas de acuerdo con una relación de tamaños particular (p. ej., una relación de tamaños de una primera microesfera a una segunda microesfera de aproximadamente 1:5, una relación de tamaños de una segunda microesfera a una tercera microesfera de aproximadamente 1:6, y una relación de tamaños de la primera microesfera a la tercera microesfera de aproximadamente 1:30).

La determinación de si la secuencia de ácido nucleico está presente en la muestra, se puede llevar a cabo por una variedad de técnicas. De acuerdo con la presente invención, se hibrida una sonda con un ácido nucleico de ITS2, indicando la detección de la hibridación que el ácido nucleico de ITS2 está presente en una muestra (y que la muestra se ha puesto en contacto con un hongo dimórfico). La sonda comprende al menos 15 nucleótidos contiguos, en algunas realizaciones al menos 20 nucleótidos contiguos, de la secuencia de la sonda: Dm (SEQ ID NO: 4). En realizaciones más particulares, la sonda consiste esencialmente en Dm.

En un aspecto la invención...

1. Procedimiento para detectar hongos dimórficos seleccionados de Histoplasma capsulatum; Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis; Penicillium marneffei; Paracoccidioides brasiliensis y un híbrido de los mismos, que comprende:

detectar la hibridación entre una sonda dimórfica y una secuencia de ácido nucleico del espaciador de transcripción interna 2 (ITS2) de un hongo dimórfico en una muestra, en el que la sonda dimórfica tiene una secuencia que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4, y en el que la presencia de la hibridación indica la presencia de un hongo dimórfico en la muestra.

2. Procedimiento para diferenciar la presencia de Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis, Penicillium marneffei, o Paracoccidioides brasiliensis, aparte de la presencia o ausencia de Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, una especie de Candida, o Pneumocystis carinii, que comprende:

poner en contacto una muestra que contiene un hongo dimórfico que tiene una secuencia de ácido nucleico del espaciador de transcripción interna 2 (ITS2) con una sonda dimórfica, en el que la sonda dimórfica tiene una secuencia que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4; y

detectar una hibridación entre la secuencia de ácido nucleico de ITS2 y la sonda dimórfica, en el que la detección o la hibridación indican la presencia de un hongo dimórfico en la muestra.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que además comprende amplificar la secuencia de ácido nucleico de ITS2 de la muestra, generando así una secuencia de ITS2 amplificada.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la secuencia de ácido nucleico de ITS2 se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa o la reacción en cadena de la polimerasa-inmunoensayo enzimático.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se usa un cebador que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en la reacción en cadena de la polimerasa o la reacción en cadena de la polimerasa-inmunoensayo enzimático.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que además comprende:

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que además comprende:

detectar una hibridación entre una sonda específica de especie o una sonda específica de microbio y una secuencia de ácido nucleico de un hongo dimórfico en la muestra.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la sonda dimórfica comprende al menos 20 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la sonda dimórfica consiste en el SEQ ID NO: 4.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la muestra es una muestra biológica o ambiental.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que detectar la hibridación comprende detectar un marcador en la sonda dimórfica.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el marcador comprende un isótopo radiactivo, sustrato enzimático, cofactor, ligando, agente quimioluminiscente, agente fluorescente, hapteno o una enzima.

16. Kit para detectar la presencia de un hongo dimórfico en una muestra biológica, que comprende: una sonda dimórfica que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4.

17. Kit de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la sonda dimórfica consiste en el SEQ ID NO: 4.

18. Kit de acuerdo con la reivindicación 16 o reivindicación 17, que además comprende un cebador que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

19. Kit de acuerdo con la reivindicación 16, que además comprende un cebador para amplificar la secuencia de ITS2.

20. Kit de acuerdo con la reivindicación 16, que además comprende una sonda específica de especie o una sonda específica de microbio.

21. Kit de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio comprende el SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

22. Ordenación para seleccionar en una muestra la presencia o contaminación por un hongo dimórfico seleccionado de: Histoplasma capsulatum; Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis; Penicillium marneffei y Paracoccidioides brasiliensis, que comprende:

una pluralidad de sondas dimórficas, en la que al menos una sonda dimórfica comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 4, y

un sustrato, en el que la pluralidad de sondas dimórficas están dispuestas sobre el sustrato.

23. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la ordenación es una microordenación.

24. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 22, en la que al menos una sonda dimórfica comprende al menos 20 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4.

25. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 24, en la que al menos una sonda dimórfica consiste en SEQ ID NO: 4.

26. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 22, que además comprende una sonda específica de especie o una sonda específica de microbio.

27. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 26, en la que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio, comprende el SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.