Una planta de algodón transgénica o semillas, células o tejidos de la misma,

que comprenden el suceso de élite EE-GH1 en su genoma, comprendiendo una semilla de referencia dicho suceso de élite depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3343, que está caracterizada porque un fragmento de ADN especifico para EE-GH1 con una longitud comprendida entre 250 y 290 pb, puede ser amplificado a partir del ADN genómico de dicha planta de algodón o de las semillas, células o tejidos de la misma, usando una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que tienen la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID No 2 y SEQ ID No 3, respectivamente

Plantas de algodón tolerantes a herbicidas y métodos para producir e identificar a las mismas.

Campo del invento Este invento se refiere a plantas de algodón transgénicas, al material de las plantas y a semillas, caracterizadas/os porque albergan un suceso de transformación específico, particularmente por la presencia de un gen que codifica una proteína que confiere tolerancia a los herbicidas, en un lugar específico en el genoma del algodón, tal como se caracteriza en las reivindicaciones. Las plantas de algodón del invento combinan el fenotipo tolerante a un herbicida con un comportamiento agronómico, una estabilidad genética y una adaptabilidad a diferentes contextos genéticos equivalentes al linaje de algodón no transformado en la ausencia de presión de malezas.

Antecedentes del invento La expresión fenotípica de un transgén en una planta es determinada tanto por la estructura del gen propiamente dicho como por su lugar en el genoma de la planta. Al mismo tiempo, la presencia del transgén en diferentes lugares del genoma influirá sobre el fenotipo global de la planta de diferentes maneras. La introducción satisfactoria desde los puntos de vista agronómico o industrial de un rasgo comercialmente interesante en una planta por manipulación genética puede ser un proceso largo y tedioso, dependiente de diferentes factores. La transformación y la regeneración reales de las plantas transformadas genéticamente son solamente la primera de una serie de etapas de selección, que incluyen una extensa caracterización genética, una crianza y una evaluación en pruebas realizadas en el campo.

Una fibra de algodón es el único material textil más importante en todo el mundo. Aproximadamente 80 millones de acres de algodón se cosechan anualmente en todo el globo terrestre. El algodón es la quinta planta más cultivada en los EE.UU. en términos de producción por superficie expresada en acres con más de 15 millones de acres plantados en el 2.000. Unas especies de malezas primarias para el algodón son Ipomoea sp. (Ipomoea violácea, en ingles morning glor y ) , Amaranthus spp. (amaranto, en ingles pigweed) , Cyperus spp. (coquillo, en ingles nutsedge) , Xanthium spp. (bardana, en ingles cocklebur) y Sorghum spp. (sorgo de pasto, en inglés johnsongrass) . Antes de la introducción de herbicidas para hojas anchas que se pudieran utilizar en un campo de algodón en crecimiento, los cultivadores usaron directamente unas aplicaciones después del brote de herbicidas no selectivos, teniendo cuidado de no entrar en contacto con las plantas cultivadas en crecimiento. Puesto que esto requiere una diferencia en altura entre las malezas y la planta cultivada, esto no es siempre posible. Especialmente para el algodón pequeño, esta práctica consume mucho tiempo y es potencialmente dañina para la planta cultivada.

El gen bar (Thompson y colaboradores, 1987, EMBO J 6:2519-2523; Deblock y colaboradores 1987, EMBO J. 6:2513-2518) es un gen que codifica la enzima fosfinotricina acetil transferasa (PAT) que, cuando se expresa en una planta, confiere una resistencia a los compuestos herbicidas fosfinotricina (también denominado glufosinato) o bialafos (véanse también por ejemplo las patentes de los EE.UU. 5.646.024 y 5.561.236) y sales e isómeros ópticos de los mismos. La fosfinotricina reprime a las malezas de hoja ancha incluyendo las Ipomoea y tiene una amplia ventana de aplicación.

Una satisfactoria transformación genética del algodón se ha obtenido por un cierto número de métodos, incluyendo la infección con Agrobacterium de explantes de algodón (véanse Firoozabady y colaboradores 1987, Plant Molecular Biology 10:105-116; Umbeck y colaboradores 1987, Bio/Technology 5:263-266 y los documentos de solicitud de patente internacional WO 00/71733, y de patentes de los EE.UU. US 5.004.863, y US 5.159.135) , así como la transferencia directa de genes por bombardeo con microproyectiles de tejidos de algodón meristemáticos (Finer y Mc Mullen, 1990, Plant Cell Reports, 5:586-589; McCabe y Martinell, 1993, Bio/Technology 11:596-598, y los documentos WO92/15675 y de patente europea EP 0 531 506) . Se ha informado de una eficiencia aumentada de transformación para la transformación con Agrobacterium usando los métodos descritos por Hansen y colaboradores (1994, Proc. Nat. Acad. Sci. 91:7603-7607) , Veluthambi y colaboradores (1989, Journal of Bacteriology 171:36963703) y el documento WO 00/71733. Se han descrito también diferentes métodos para la regeneración de plantas de algodón (documentos WO 89/05344, US 5.244.802, US 5.583.036, WO89/12102, WO98/15622 y WO97/12512) .

Sin embargo, los precedentes documentos no han sido capaces de enseñar ni sugerir el presente invento.

Sumario del invento

El presente invento se refiere a una planta de algodón transgénica, o a semillas, células o tejidos de la misma, que comprende integrada establemente dentro de su genoma, una casete de expresión que comprende un gen de tolerancia a un herbicida, que comprende a su vez la secuencia de codificación del gen bar (tal como se describe en el Ejemplo 1.1 en el presente texto) , que es tolerante a herbicidas y que, en la ausencia de presión por malezas, tiene un comportamiento agronómico que es sustancialmente equivalente al isolinaje no transgénico tal como se caracteriza en las reivindicaciones. Bajo presión de malezas y el apropiado tratamiento con Liberty®, la planta tendrá un fenotipo agronómico superior comparado con el de la planta no transgénica.

En una forma de realización del invento, la planta de algodón o las semillas, las células o los tejidos de la misma, comprende (n) la casete de expresión de pGSV71 (tal como se describe en el Ejemplo 1.1, Tabla 1 en el presente texto) . La planta de algodón o las semillas, las células o los tejidos de la misma comprende (n) el suceso de élite EE-GH1.

En otra forma de realización del invento, la planta de algodón transgénica o las semillas, las células o los tejidos de la misma comprende (n) :

(i) el suceso EE-GH1 en su genoma; o

(ii) el suceso EE-GH1 con la condición de que el gen bar usado en el suceso ha de ser sustituido con una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con el complemento del gen bar en condiciones rigurosas.

Más específicamente, el presente invento se refiere a una planta de algodón transgénica, y a semillas, células o tejidos de la misma, cuyo ADN genómico está caracterizado por el hecho de que, cuando se analiza en un protocolo de identificación por PCR tal como se describe aquí, usando dos cebadores dirigidos a la región flanqueadora en 5'

o 3' de EE-GH1 y el ADN ajeno, respectivamente, proporciona un fragmento que es específico para EE-GH1. Los cebadores están dirigidos contra la región flanqueadora en 5' dentro de la SEQ ID NO: 1 y el ADN ajeno respectivamente; los cebadores comprenden la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, y proporcionan un fragmento de ADN con una longitud entre 250 y 290 pb (pares de bases) , de manera preferible de aproximadamente 269 pb.

Una semilla de referencia, que comprende el suceso de élite del invento. ha sido depositada en la colección ATCC bajo el número de acceso PTA-3343. Por lo tanto, una forma de realización del invento es la semilla que comprende el suceso de élite EE-GH1 depositado como el número de acceso en la ATTC PTA-3343, que crecerá para formar una planta de algodón resistente al glufosinato. La semilla con el número de depósito en la ATCC PTA-3343, procede de un lote de semillas que se compone en aproximadamente un 50 % de almendras no transgénicas y en un 50 % de almendras transgénicas que son hemicigóticas para el transgén que comprende el suceso de élite del invento, y que crecerán para formar plantas tolerantes al glufosinato. La semilla puede ser sembrada y las plantas en crecimiento pueden ser tratadas con PPT o Liberty®, tal como aquí se describe, para obtener unas plantas tolerantes al glufosinato en un 100 %, que comprenden el suceso de élite del invento. El invento se refiere además a las células, los tejidos, la progenie y los descendientes procedentes de una planta que comprende el suceso de élite del invento, que ha crecido a partir de la semilla depositada en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-3343. El invento se refiere además a plantas obtenibles por propagación de y/o crianza con una planta de algodón que comprende el suceso de élite del invento que ha crecido a partir de la semilla depositada en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-3343.

También se describen en el presente texto plantas, semillas, células... [Seguir leyendo]

1. Una planta de algodón transgénica o semillas, células o tejidos de la misma, que comprenden el suceso de élite EE-GH1 en su genoma, comprendiendo una semilla de referencia dicho suceso de élite depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3343, que está caracterizada porque un fragmento de ADN especifico para EE-GH1 con una longitud comprendida entre 250 y 290 pb, puede ser amplificado a partir del ADN genómico de dicha planta de algodón o de las semillas, células o tejidos de la misma, usando una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que tienen la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID No 2 y SEQ ID No 3, respectivamente.

2. Una planta de algodón transgénica o semillas, células o tejidos de la misma de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicho fragmento de ADN es un fragmento de aproximadamente 269 pb.

3. Una planta de algodón transgénica o semillas o células de tejidos de la misma, que comprenden el suceso de élite EE-GH1 en su genoma, que se ha obtenido por propagación de y/o crianza con la planta de algodón transgénica de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Un método para identificar el suceso de élite EE-GH1, comprendiendo la semilla de referencia dicho suceso de élite depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3343, en muestras biológicas, cuyo método comprende detectar una región específica para el EE-GH1 con unos cebadores que reconocen específicamente a la región flanqueadora en 5' o a la región flanqueadora en 3' de dicho suceso de élite, comprendiendo dicho método amplificar un fragmento de ADN que tiene un longitud comprendida entre 100 y 350 pb a partir de un ácido nucleico presente en dichas muestras biológicas, usando una reacción en cadena de la polimerasa con por lo menos dos cebadores, un primer cebador reconoce a una secuencia situada entre los nucleótidos 1-677 de la SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador reconoce a una secuencia complementaria situada entre los nucleótido.

67. 850 de la SEQ ID NO: 1, o un primer cebador reconoce a una secuencia situada entre los nucleótidos 1-179 de la SEQ IDNO: 4 y un segundo cebador reconoce a una secuencia complementaria situada entre los nucleótido.

18. 426 de la SEQ ID NO: 4.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dichos cebadores usados en una reacción en cadena de la polimerasa comprenden las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

6. Un estuche para identificar el suceso de élite EE-GH1, comprendiendo una semilla de referencia dicho suceso de élite depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3343, en muestras biológicas, comprendiendo dicho estuche por lo menos dos cebadores de PCR, un primer cebador reconoce a una secuencia situada entre los nucleótidos 1-677 de la SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador reconoce a una secuencia complementaria situada entre los nucleótido.

67. 850 de la SEQ ID NO: 1, o un primer cebador reconoce a una secuencia situada entre los nucleótidos 1-179 de la SEQ ID NO: 4 y un segundo cebador reconoce a una secuencia complementaria situada entre los nucleótido.

18. 426 de la SEQ ID NO: 4.

7. El estuche de la reivindicación 6, en el que un primer cebador comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3.

8. Una molécula de ADN que puede ser amplificada a partir de una muestra de ácido nucleico de algodón transgénico, que comprende el suceso de élite EE-GH1 en su genoma, comprendiendo una semilla de referencia dicho suceso de élite depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-3343, usando un conjunto de cebadores, el primero de los cuales comprende una secuencia de 15 a 30 nucleótidos y reconoce a una secuencia situada entre los nucleótidos 1-677 de la SEQ ID NO: 1 y el segundo cebador reconoce a una secuencia complementaria entre los nucleótido.

67. 850 de la SEQ ID NO: 1, o un primer cebador reconoce a una secuencia situada entre los nucleótidos 1-179 de la SEQ ID NO: 4 y un segundo cebador reconoce a una secuencia complementaria situada entre los nucleótido.

18. 426 de la SEQ ID NO: 4 en dicha muestra de ácido nucleico de algodón.

9. La molécula de ADN de la reivindicación 8, que puede ser amplificada a partir de la muestra de ácido nucleico de algodón transgénico, usando un conjunto de cebadores, el primero de los cuales comprende la SEQ ID NO: 2 y el segundo de los cuales comprende la SEQ ID NO: 3.