RESISTENCIA A MILDIÚ VELLOSO DE CEBOLLA PROVOCADO POR EL HONGO PERONOSPORA.

Planta de la especie Allium cepa que es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) debido a un locus de resistencia a Pd presente de manera homocigota en el brazo largo del cromosoma 3 en el genoma de dicha planta,

en la que el locus de resistencia a Pd es el fragmento de introgresión de Allium roylei en el genoma de una planta de la línea 3591-1, número de registro NCIMB 41249, y en la que, se lleva a cabo el siguiente procedimiento: a) realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con las enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar un ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido: alfa 5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA CATCTGACGCATGT-5', y beta 5'-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5'; c) amplificar selectivamente conjuntos de fragmentos de restricción, caracterizándose la presencia del locus de resistencia a Pd por &8226; un producto de amplificación de 61 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c): (A) 5'-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5'-GATGAGTCCTGAGTAACTT, &8226; un producto de amplificación de 151 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c): (B) 5'-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5'-GATGAGTCCTGAGTAAAAC y &8226; un producto de amplificación de 330 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c): (C) 5'-GACTGCGTACATGCAGACA y 5'-GATGAGTCCTGAGTAACCA

La presente invención se refiere a plantas del género Allium que son resistentes al mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) (Berk.) Cas., específicamente plantas de la especie Allium cepa. Según la invención, la resistencia se proporciona mediante un locus de resistencia, que puede estar presente de manera homocigota

o heterocigota en el genoma de la planta, y que es suficiente para proporcionar resistencia a plantas que llevan este locus. Se dan a conocer procedimientos para obtener dichas plantas resistentes a mildiú velloso de cebolla, siendo adecuados dichos procedimientos para obtener cebollas y chalotes cultivados.

Antecedentes de la invención [0002] El mildiú velloso provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) tiene una distribución prácticamente mundial. El patógeno ataca diversos tipos de cebollas, pero es especialmente destructivo para la cebolla común Allium cepa. El daño provocado por el hongo se describe en Mukerji (ref. 5). Pueden producirse epidemias espontáneas en el campo, si las condiciones son favorables para la enfermedad. Los síntomas son amarilleo de las hojas y esporulación gris. [0003] Desde un punto de vista económico, el mildiú velloso es una de las principales enfermedades fúngicas que amenazan el cultivo de cebollas y chalotes (Allium cepa L.), en casi todas las regiones de cultivo de cebollas en el mundo. [0004] Se supone que no está presente una resistencia natural completa a mildiú velloso en Allium cepa y Allium fistulosum. Sin embargo, se encontró una resistencia completa a mildiú velloso en el Allium roylei Stearn de tipo natural. Basándose en una determinada semejanza morfológica entre A. roylei y A. cepa se ha propuesto, por tanto, usar A. roylei como una pareja de introgresión para A. cepa. En la publicación de van der Meer y de Vries (ref. 1) se notificaron resultados preliminares referentes a un híbrido de este tipo entre A. roylei y A. cepa, así como resultados referentes al retrocruzamiento del híbrido interespecífico para A. cepa. Se ha observado que dicho híbrido interespecífico es fértil para machos y hembras (Kofoet et al., ref. 2). También se ha notificado que puede heredarse de manera dominante una resistencia a mildiú velloso en la progenie BC1 (primer retrocruzamiento) de este híbrido para cebolla. [0005] El locus en el genoma de la especie cepa, en el que se encuentran las secuencias de introgresión responsables de la resistencia, se ha denominado “locus de resistencia a Pd”. Por extensión, el “locus de resistencia a Pd” también designa las propias secuencias. [0006] Sin embargo, se observa segregación para la resistencia a mildiú velloso entre las progenies BC1 y F2 procedentes de F1 entre A. roylei y A. cepa (de Vries et al., ref. 3) y nunca se ha obtenido ninguna variedad de cebollas para reproducción resistentes a mildiú velloso, más de 10 años después de que se obtuvo el primer híbrido resistente. [0007] Existe así un gran interés desde un punto de vista agronómico y económico por plantas de la especie Allium cepa, que sean resistentes a mildiú velloso y que aún sean 100% resistentes tras la autopolinización, es decir no haya segregación de la característica de resistencia. Estas plantas son particularmente valiosas ya que de hecho pueden cruzarse con una línea sensible, produciendo híbridos que también son resistentes a mildiú velloso de cebolla. [0008] La invención reside en primer lugar en la observación de que todo material resistente disponible de las especies de Allium cepa y Allium fistulosum era de hecho heterocigoto para las secuencias de resistencia a Pd y que hasta ahora no se ha obtenido ni se ha dado a conocer ninguna planta resistente homocigota de manera reproducible. [0009] Los presentes inventores elucidaron la razón por la que no podía obtenerse ninguna planta resistente de manera homocigota y entonces tuvieron éxito en obtener tales plantas de Allium, que da origen a una progenie tras autopolinización que también es 100% resistente (es decir, una planta resistente de manera homocigota). [0010] Varias hipótesis podrían haber explicado el notable hallazgo de que no estaba disponible ninguna planta homocigota: translocación, recombinación, selección preferente de híbridos, silenciamiento génico y efectos pleiotrópicos, arrastre genético (linkage drag), etcétera... [0011] Los presentes inventores han determinado que el fragmento de introgresión de Allium roylei que está presente en el hibrido de la especie cepa y que confiere resistencia a mildiú velloso comprende también una secuencia designada “factor letal”, cuya presencia en ambos homólogos de cromosoma en la especie cepa es letal para la planta. Para que exista y crezca una planta de cepa resistente, el fragmento de introgresión, que confiere resistencia y que contiene el factor letal, está por tanto necesariamente presente en un único homólogo de cromosoma, explicando la ausencia de plantas resistentes obtenidas de manera homocigota por los predecesores. Esta secuencia responsable de letalidad está presente en las proximidades del locus de resistencia a Pd. [0012] Habiendo identificado que la secuencia que confiere resistencia está ligada a la secuencia letal, los presentes inventores han tenido éxito, por primera vez, en la separación física de la secuencia que confiere resistencia de la secuencia responsable de letalidad cuando están presentes en ambos cromosomas. [0013] Esta etapa de separación, que puede producirse mediante un acontecimiento de recombinación, es el punto clave de la presente invención. En efecto, no podría preverse que las secuencias que confieren resistencia pudieran separarse del factor letal. En primer lugar, no se sabía si dicho factor era una secuencia que en sí misma era letal o si la letalidad surgía como resultado de la sustitución, por secuencias presentes en un fragmento de introgresión, de secuencias endógenas esenciales. En efecto, es posible que la letalidad sea de hecho una inactivación del/de los gen(es) esencial(es) en el fragmento de la especie cepa correspondiente que no se compensan con el fragmento introducido de A. roylei. Por tanto, eran posibles diferentes escenarios para explicar la letalidad:

- las secuencias de resistencia podrían haber constituido

de hecho el factor letal, porque sustituyen secuencias

- las secuencias de resistencia y las secuencias letales podrían haber estado extremadamente cerca entre sí en el cromosoma, o incluso solaparse. En esta situación, la probabilidad de obtener un acontecimiento de recombinación que separe a ambas es insignificante.

- las secuencias que constituyen el factor letal podrían haber sido necesarias para el funcionamiento de la resistencia. En esta condición, separar ambas conduciría a la pérdida de la capacidad de resistencia.

En este contexto, los presentes inventores han tenido éxito inesperadamente en la separación de las secuencias que confieren el fenotipo de resistencia de la secuencia cuya presencia en ambos homólogos es letal. [0015] Los inventores también han encontrado que la A. cepa resistente ya liberada presenta tanto el locus de resistencia a Pd (que es dominante) como el factor letal (que se hereda de manera recesiva) en el mismo fragmento de introgresión. Como el locus de resistencia a Pd es dominante, el fenotipo de la planta es “resistente” y no se observa el factor letal recesivo. Sin embargo, la progenie de tales plantas cuando se cruzan con plantas sensibles se segregará y por tanto no puede usarse comercialmente. En efecto, las cebollas y los chalotes comerciales son generalmente variedades, por tanto material vegetal, ya sean líneas o híbridos, con un fenotipo que tiene que ser uniforme; no pueden concebirse rasgos de interés con segregación para plantas comerciales. [0016] Por tanto, la presente invención proporciona plantas de la especie Allium cepa que son resistentes a mildiú velloso de cebolla provocado por Peronospora destructor (Pd) debido a la presencia en su genoma de un locus de resistencia a Pd, y dichas plantas son plantas resistentes de manera homocigota, es decir plantas que proporcionan una progenie tras autofecundación que también es 100% resistente. [0017] La presente invención también proporciona plantas resistentes que pueden obtenerse cruzando las plantas resistentes mencionadas anteriormente de la especie Allium cepa con una planta también de la especie Allium cepa que es sensible al mildiú velloso. [0018] También se dan a conocer procedimientos para obtener dichas plantas....

1. Planta de la especie Allium cepa que es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) debido a un locus de resistencia a Pd presente de manera homocigota en el brazo largo del cromosoma 3 en el genoma de dicha planta, en la que el locus de resistencia a Pd es el fragmento de introgresión de Allium roylei en el genoma de una planta de la línea 3591-1, número de registro NCIMB 41249, y en la que, se lleva a cabo el siguiente procedimiento:

a) realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con las enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar un ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido:

alfa 5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA CATCTGACGCATGT-5', y beta 5'-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5'; c) amplificar selectivamente conjuntos de fragmentos de restricción, caracterizándose la presencia del locus de resistencia a Pd por

• un producto de amplificación de 61 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(A) 5'-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5'-GATGAGTCCTGAGTAACTT,

• un producto de amplificación de 151 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(B) 5'-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5'-GATGAGTCCTGAGTAAAAC y

• un producto de amplificación de 330 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(C) 5'-GACTGCGTACATGCAGACA y 5'-GATGAGTCCTGAGTAACCA.

2. Planta según la reivindicación 1, en la que no hay segmento de introgresión de Allium roylei excepto en el brazo largo de ambos homólogos del cromosoma 3.

3. Planta según la reivindicación 1, en la que el fragmento de introgresión es inferior al 20% de la longitud del brazo largo del cromosoma 3.

4. Planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que puede obtenerse a partir de un cruzamiento interespecífico entre Allium roylei resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) y Allium cepa tras varios retrocruzamientos con la planta de la especie Allium cepa y luego autopolinizaciones.

5. Planta de la especie Allium cepa según la reivindicación 1 ó 4, que puede obtenerse mediante el siguiente procedimiento:

a) realizar un cruzamiento interespecífico entre Allium roylei y Allium cepa; b) seleccionar un híbrido interespecífico, resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd); c) realizar el retrocruzamiento de dicho híbrido con plantas de Allium cepa; d) seleccionar plantas resistentes a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd); e) autopolinizar las plantas así obtenidas; f) seleccionar plantas resistentes de manera homocigota a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd).

6. Planta según la reivindicación 5, en la que las etapas c) y d) se repiten al menos una vez.

7. Planta según la reivindicación 5 ó 6, en la que las etapas e) y f) se repiten al menos una vez.

8. Planta según la reivindicación 5, en la que dicha selección en la etapa b), d) o f) se lleva a cabo usando la técnica de AFLP™ con el procedimiento y los cebadores dados a conocer en la reivindicación 1.

9. Planta de Allium cepa híbrida que puede obtenerse cruzando una línea parental de Allium cepa, que es sensible a mildiú velloso provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd), con una planta según la reivindicación 1, en la que dicha planta híbrida es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) debido a un locus de resistencia a Pd presente de manera heterocigota en el brazo largo del cromosoma 3 en el genoma de dicha planta, en la que el locus de resistencia a Pd es el fragmento de introgresión de Allium roylei en el genoma de una planta de la línea 3591-1 número de registro NCIMB 41249, y en la que, se lleva a cabo el siguiente procedimiento:

a) realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar el ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido:

alfa 5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA CATCTGACGCATGT-5', y beta 5'-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5';

c) amplificar selectivamente conjuntos de fragmentos de restricción, caracterizándose la presencia del locus de resistencia a Pd por

5 • un producto de amplificación de 61 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(A) 5'-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5'-GATGAGTCCTGAGTAACTT,

• un producto de amplificación de 151 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(B) 5'-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5'-GATGAGTCCTGAGTAAAAC y

• un producto de amplificación de 330 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(C) 5'-GACTGCGTACATGCAGACA y 5'-GATGAGTCCTGAGTAACCA.

10. Planta de Allium cepa híbrida según la reivindicación 9, en la que la línea parental es una línea endogámica de Allium cepa estéril macho citoplasmática.

11. Planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, siendo dicha planta una cebolla o chalote cultivado.