DETECCIÓN DE LA RESISTENCIA A TRIAZOL EN ASPERGILLUS.

Un procedimiento de detección de Aspergillus resistente a triazol en una muestra,

que comprende (A) evaluar dicha muestra en busca de la presencia de un gen que codifica un factor de transcripción AzRF1 (SEC ID Nº 2), en el que dicho factor de transcripción AzRF1 contiene una mutación de una deleción de los restos QSQS en la posición 559-562 y (B) correlacionar la presencia de dicha mutación con la presencia dicho Aspergillus resistente a triazol

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/062463.

Solicitante: MYCONOSTICA LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: SOUTH COURT SHARSTON ROAD SHARSTON MANCHESTER M22 4SN REINO UNIDO.

Inventor/es: ROCHA,Eleusa Maria,F, PARK,Steven, PERLIN,David,S.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 2 de Mayo de 2008.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68M10F

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2373496_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Detección de la resistencia a triazol en Aspergillus

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/916.193, presentada el 4 de mayo de 2007.

Antecedentes

Las infecciones fúngicas son una causa significativa de morbilidad y mortalidad en diversos pacientes gravemente enfermos. Por ejemplo, los hongos pueden causar infecciones superficiales y a menudo diseminadas fatales en pacientes inmunodeficientes. Las infecciones fúngicas sistémicas causan aproximadamente el 25 % de las muertes relacionadas con infección en pacientes leucémicos y el 5-10 % de las muertes en pacientes que se han sometido a transplante de pulmón, páncreas o hígado. También se sabe que se produce septicemia fúngica adquirida en hasta el 13 % de lactantes nacidos con poco peso. Los miembros del género Aspergillus son la segunda causa más común de infecciones fúngicas, tras los miembros del género Candida.

Las infecciones fúngicas causadas por miembros del género Aspergillus se tratan habitualmente con triazoles. Los triazoles actúan bloqueando la ruta biosintética de ergosterol en la fase de desmetilación del C14. Chamilos et al. Drug Resistance Updates (2005) 8: 344-358. Los triazoles incluyen, por ejemplo, voriconazol, isavuconazol, ravuconazol, itraconazol y posaconazol. Aunque los triazoles han sido eficaces en el tratamiento de infecciones fúngicas por Aspergillus, ha habido un aumento de la resistencia de Aspergillus al tratamiento con triazol. Chamilose et al., supra. Dicha resistencia puede hacer ineficaz al tratamiento con triazol.

Reconocer si una infección fúngica particular comprende Aspergillus resistente a triazol es importante para proporcionar la atención adecuada a los pacientes. Por lo tanto, se necesitan procedimientos para determinar si un hongo Aspergillus particular es susceptible al tratamiento con triazol.

Resumen

En un aspecto, se proporcionan procedimientos para detectar hongos resistentes a triazol en una muestra que comprende evaluar la muestra en busca de la presencia de un gen que codifica un factor de transcripción AzRF1 mutante, en el que el AzRF1 mutante contiene una deleción de los restos QSQS en la posición 559-562 de dicho gen y correlacionar la presencia del gen mutante con la presencia del hongo resistente a triazol. En algunos aspectos, la evaluación implica medir el nivel de expresión de dicho gen. En algunas realizaciones, la evaluación comprende poner en contacto a dicha muestra con un oligonucleótido capaz de hibridar con dicho gen mutante. El oligonucleótido puede comprender un marcador detectable. En un ejemplo, el oligonucleótido comprende un fluoróforo y un cromóforo, mientras que en otro, el oligonucleótido comprende un fluoróforo y un desactivador de fluorescencia no fluorescente.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 6. En una realización, el oligonucleótido puede comprender más del 90 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 6. En otra, el oligonucleótido puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 7, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9.

En algunos aspectos, el gen mutante se amplifica antes de dicha hibridación. La amplificación puede comprender PCR. La amplificación también puede comprender poner en contacto a la muestra con cebadores que tienen la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 3 y la SEC ID Nº 4.

En otras realizaciones, el hongo resistente a triazol pertenece al género Aspergillus. El hongo resistente a triazol puede ser Aspergillus fumigatus.

En algunos casos, el hongo resistente a triazol es resistente a itraconazol, posaconazol, voriconazol, isavuconazol o ravuconazol.

En otra realización, un procedimiento de detección de hongos resistentes a triazol en una muestra comprende (A) evaluar la muestra en busca de la presencia de un gen que codifica un factor de transcripción AzRF1 y (B) correlacionar la presencia del gen con la presencia del hongo resistente a triazol. En algunos aspectos, la evaluación implica medir el nivel de expresión del gen.

En otro aspecto, se proporciona un kit para detectar hongos resistentes a triazol en una muestra que comprende un oligonucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 6 o una secuencia con más del 90 % de homología con la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 6. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende un marcador y el kit comprende además uno o más cebadores de amplificación.

Otros objetos, características y ventajas se volverán evidentes a partir de la siguiente descripción. La descripción detallada y los ejemplos específicos se proporcionan solamente como ilustración. Además, los ejemplos demuestran el principio de la invención y no puede esperarse ilustrar específicamente la aplicación de esta invención para todos los ejemplos donde será obviamente útil para los especialistas en la técnica anterior.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un alineamiento de secuencia de la región del dominio de unión a ADN del agrupamiento binuclear Zn2Cys6 similar GAL4 de los 8 supuestos factores de transcripción en A. fumigatus.

La figura 2 muestra un alineamiento de secuencia de aminoácidos de factores de transcripción AzRF1 de tipo silvestre y mutante.

La figura 3 proporciona una secuencia de ARNm parcial (SEC ID Nº 1) del factor de transcripción C6 (AzRF1) de Aspergillus fumigatus Af293 (AFUA_5G06800) como se indica en el GeneBank en giI70998461IrefIXM_748860.1.

La figura 4 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 2) del factor de transcripción C6 (AzRF1) de Aspergillus fumigatus Af293, como se indica en el GeneBank en giI70998462IrefIXP_753953.1.

Descripción de las secuencias La SEC ID Nº 3, 5'-CGGTTAGCGTCGATGCTGC-3', es un cebador directo ejemplar para reacciones de amplificación.

La SEC ID Nº 4, 5'-AGGACATCTCCGAGCGGTC-3', es un cebador inverso ejemplar para reacciones de amplificación.

La SEC ID Nº 5, 5'-CCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAT-3', es una sonda de detección ejemplar.

La SEC ID Nº 6, 5'-ACCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCATT-3', es otra sonda de detección ejemplar.

La SEC ID Nº 7, 5'-CGGCAGCCCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCATGCTGCCG-3', es una sonda de detección ejemplar.

La SEC ID Nº 8, 5'-CGGCGGCACCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCATTGCCGCCG-3', es otra sonda de detección ejemplar.

La SEC ID Nº 9, 5'-CGGCGGCCCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCATGCCGCCG-3', es otra sonda de detección ejemplar.

Descripción detallada Los inventores han descubierto regiones de ADN específicas de hongos mutantes que son resistentes a fármacos con triazol. Por consiguiente, estas regiones de ADN pueden usarse para determinar si una muestra contiene hongos resistentes a triazol. Por lo tanto, se proporcionan procedimientos de detección de hongos resistentes a triazol, como son nuevas sondas y cebadores que pueden usarse para detectar estas regiones.

Detección de resistencia a triazol En un aspecto, se proporcionan procedimientos para detectar hongos resistentes a triazol en una muestra, que comprenden evaluar la muestra en busca de la presencia de un gen que codifica un factor de transcripción AzRF1 mutante. En una realización, los procedimientos comprenden evaluar la muestra en busca de la presencia de un gen que codifica un factor de transcripción AzRF1 mutante, en los que el AzRF1 mutante contiene una deleción de los restos QSQS en la posición 559-562 del gen y correlacionar la presencia del gen mutante con la presencia del hongo resistente a triazol.

En otra realización, la resistencia a triazol puede evaluarse en hongos midiendo la actividad del gen AzRF1 en los hongos. En particular, se ha descubierto que los hongos resistentes a triazol poseen cantidades anormales del factor de transcripción AzRF1. Por lo tanto, la medición del número de copias del gen AzRF1 o sus niveles de expresión puede ser útil para detectar resistencia a triazol. En algunos aspectos, dichos procedimientos de detección implican evaluar si la actividad del gen AzRF1 en las cepas fúngicas de ensayo es 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces o más superior a los niveles típicos.

Pueden obtenerse... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de detección de Aspergillus resistente a triazol en una muestra, que comprende

(A) evaluar dicha muestra en busca de la presencia de un gen que codifica un factor de transcripción AzRF1 (SEC ID Nº 2) , en el que dicho factor de transcripción AzRF1 contiene una mutación de una deleción de los restos QSQS en la posició.

55. 562 y

(B) correlacionar la presencia de dicha mutación con la presencia dicho Aspergillus resistente a triazol.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la evaluación implica medir el nivel de expresión de dicho gen.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha evaluación comprende poner en contacto a dicha muestra con un oligonucleótido capaz de hibridar con dicho gen mutante.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende además amplificar dicho gen mutante antes de dicha hibridación.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha amplificación comprende PCR.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha amplificación comprende poner en contacto a la muestra con cebadores que tienen las secuencias de ácido nucleico de la SEC ID Nº 3 y la SEC ID Nº 4.

7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho oligonucleótido comprende un marcador detectable.

8. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho oligonucleótido comprende un fluoróforo y un cromóforo.

9. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho oligonucleótido comprende un fluoróforo y un desactivador de fluorescencia no fluorescente.

10. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho oligonucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 6.

11. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho oligonucleótido comprende más del 90 % de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 6.

12. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho oligonucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 7, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el Aspergillus resistente a triazol es Aspergillus fumigatus.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el Aspergillus resistente a triazol es resistente a itraconazol, posaconazol, voriconazol, isavuconazol o ravuconazol.

15. Un kit para detectar Aspergillus resistente a triazol en una muestra, que comprende un oligonucleótido que tiene la secuencia SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 6 o una secuencia con más del 90 % de homología con la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 6, en el que dicho oligonucleótido comprende preferiblemente un marcador y en el que dicho kit comprende preferiblemente además uno o más cebadores de amplificación.

 

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