Secuencias oligonucleotídicas 5'-TCTGGTGCTGGTAACTGG-3' (TubB16sp.

/fw) y 5'-GAGAATGTCAGCATCATGCG-3' (TubB16sp./rev) que pueden asociarse con la secuencia génica de la b-tubulina de plantas

Procedimiento para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de especies vegetales.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a cebadores para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de especies vegetales la monitorización de variabilidad genética de especies vegetales.

La presente invención también se refiere a un kit para reconocer las diferentes variedades de especies vegetales.

Estado de la técnica

El desarrollo de sistemas eficaces, sencillos y rigurosos para la monitorización de la variabilidad genética que existe entre las diferentes especies vegetales, por ejemplo, entre plantas cultivadas y plantas silvestres presentes dentro del territorio, es uno de los objetivos más importantes de la agrobiología moderna. De hecho, se desea proporcionar un instrumento eficaz para el reconocimiento y la tipificación de las variedades de vegetales cultivadas que tienen un interés económico, con el fin de proteger su identidad, salvaguardarlas frente a posibles problemas de contaminación y fraude y también con el fin de seguir el desarrollo de programas de cruzamiento genético. De hecho, dada la extrema sofisticación de la demanda y la oferta del mercado agroalimentario, se requieren controles cada vez más rigurosos para proteger las variedades comercializadas. Además, al utilizar los sistemas anteriores, es posible establecer un modelo experimental que permita la monitorización de las especies vegetales cultivadas y silvestres que existen dentro de un territorio determinado, con el fin de protegerlas frente al peligro de la extinción o la erosión genética.

El problema de la conservación de la biodiversidad tal como se define internacionalmente por el Convenio de Río de Janeiro (1992) se ha convertido en uno de los principales argumentos presentados a la atención de la opinión pública en todo el mundo, ya que en una fase caracterizada por una excesiva uniformidad de cultivos, es necesario conservar aquellos genes, genotipos y reservas genéticas que son potencialmente útiles en procedimientos de producción que pueden lograrse mediante métodos tradicionales de mejora genética o métodos de innovación tales como los biotecnológicos. Las propias normas emitidas por la Unión Europea, sensibles a la protección de productos típicos de tradiciones populares y medioambientales, pueden acelerar (si se utilizan adecuadamente por las regiones en colaboración con institutos de investigación y asociaciones de agricultores) el logro de los objetivos dirigidos a detener el proceso de erosión genética en las áreas más interesantes, obteniendo al mismo tiempo la valorización de productos minoritarios, con la posibilidad de estimular los nuevos procedimientos de diversificación de las especies utilizadas. Por tanto, la monitorización y la determinación de la variabilidad genética que existe entre organismos vegetales son objetos estrictamente asociados con el desarrollo de una agricultura competitiva y con visión de futuro.

El problema de la evaluación de la variabilidad genética que existe entre las plantas cultivadas y silvestres de una manera fiable y rápida se siente profundamente. La genética molecular es en la actualidad la disciplina más adecuada para satisfacer tal necesidad, mediante los procedimientos de diagnóstico de ADN. Debido a su propia naturaleza, la variabilidad genética está intrínsecamente unida a los polimorfismos presentes en la molécula de ADN que, sin embargo, deben identificarse correctamente y asociarse unívocamente con una especie vegetal determinada y también con características específicas de relevancia agroeconómica de la planta que está examinándose.

Los métodos genéticos moleculares son rápidos, dúctiles y fiables, y el análisis de diagnóstico de ADN ha encontrado grandes campos de aplicación en la ciencia médica así como la forense.

La genética molecular ofrece en la actualidad tres soluciones principales para el problema de la monitorización de la variabilidad genética en las especies vegetales, los procedimientos aplicados se indican con las siguientes abreviaturas: RFLP (polimorfismos de longitud de fragmento de restricción), RADP (ampliación al azar de ADN polimórfico), MRP (polimorfismos de repetición de microsatélites).

La técnica de RFLP usa un procedimiento para la identificación de polimorfismos de ADN mediante métodos de transferencia de los mismos sobre soportes de nailon y la hibridación molecular posterior. La técnica es eficaz si se tiene un gran número de sondas moleculares y se desea construir con ellas mapas genéticos enteros. Si esto se adopta teniendo el único objetivo de identificar la variabilidad genética, la técnica es laboriosa y requiere el uso de una gran cantidad de ADN genómico, no puede automatizarse y también requiere el marcaje radioactivo de las sondas. La técnica de RAPD y sus variantes (AP-PCR, DAF) son técnicas de bajo coste, muy rápidas que necesitan poco ADN genómico y ninguna sonda radioactiva. Sin embargo, estas técnicas tienen un riesgo bastante alto de no reproducibilidad que produce pruebas de posibles polimorfismos que a menudo, si no siempre, carecen de cualquier característica de interés agrónomo. Esto sustancialmente es una mera ampliación de regiones no conocidas y aleatorias de ADN genómico.

La técnica de MRP se basa en la ampliación de las regiones que contienen secuencias de ADN repetidas que tiene un alto contenido de dinucleótidos específicos (por ejemplo, AT). También en este caso, el análisis es rápido y no requiere el uso de compuestos radioactivos o grandes cantidades de ADN genómico. Sin embargo, la identificación de los productos ampliados puede ser laboriosa, ya que es necesario reemplazar el gel de agarosa por un gel de acrilamida, y es poco informativa dado que las secuencias repetidas en el genoma no siempre se dispersan o están ubicadas cerca de genes que son importantes para la planta. Además esta técnica así como el RFLP parecen ser más adecuadas para la construcción de mapas genéticos que para el análisis puro y sencillo de la existencia de variabilidad genética.

Koga-Ban et al. (DNA Resaerch, 1995, 2, 21-26) dan a conocer una comparación entre secuencias de ADNc que se derivan de tres tipos de b-tubulinas de arroz. El objetivo del estudio es identificar la resistencia a una enfermedad específica de la planta con el fin de modificar genéticamente plantas no resistentes similares para hacer que también sean resistentes a la enfermedad.

Breviario et al. (Plant Physiology, 1995, 108 (2), 823-4) dan a conocer la caracterización de la familia del gen de b-tubulina de arroz mediante la evaluación de los ADNc correspondientes.

Objetivos de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar cebadores según las reivindicaciones 1 y 2 para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de especies vegetales tales como para permitir establecer un índice de diversidad entre las especies cultivadas de importancia agrónoma.

Otro objeto de la invención es proporcionar dichos cebadores para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de especies vegetales tale como para permitir el reconocimiento de contaminaciones de variedades y/o infestación y de especies que resisten de manera natural a agentes patógenos o al estrés ambiental. Otro objeto de la invención es proporcionar dichos cebadores para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de especies vegetales que pueden utilizarse para el desarrollo de nuevos programas de cruzamiento genético y remezcla de caracteres.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar dichos cebadores para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de especies vegetales que pueden asociarse a programas con la intención de mantener la biodiversidad natural típica de un territorio o nicho ecológico.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar dichos cebadores para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de especies vegetales que es rápida, económica, precisa y ampliamente aplicable.

Todavía un objeto adicional de la invención es proporcionar un kit para el reconocimiento de la variabilidad genética de especies vegetales tal como para permitir efectuar una evaluación rápida, fiable y económica de la variedad.

Descripción de la invención

Estos y todavía...

1. Secuencias oligonucleotídicas 5'-TCTGGTGCTGGTAACTGG-3' (TubB16sp./fw) y 5'-GAGAATGTCAGCATCATGCG-3' (TubB16sp./rev) que pueden asociarse con la secuencia génica de la b-tubulina de plantas.

2. Secuencias oligonucleotídicas 5'-AGGCTGAGAACTGCGACTGC-3' (BTKdl-fw) y 5'-GAGAATGTGAGCATCATGCG-3' (BTKdl-rev) que pueden asociarse con la secuencia génica de la b-tubulina de plantas.

3. Kit para el reconocimiento de las diferentes variedades de especies vegetales que comprende una o más secuencias oligonucleotídicas según las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Uso del kit según la reivindicación 3 para la determinación de las diferentes variedades.