Un procedimiento de inducción o modelado del estado patológico de una proteína de enfermedad por agregación (PEA) que se asocia con un estado patológico en el que la PEA se agrega patológicamente mediante una interacción de polimerización conformacional inducida,

estando caracterizado el procedimiento por la fase de proporcionar una proteína de fusión localizada en la membrana que comprende

i) una porción de agregación, que deriva de la PEA,

ii) una porción de localización en membrana heteróloga,

en el que dicho procedimiento se realiza in vitro o se realiza en una célula cultivada o línea celular, o se realiza en un animal no humano.

Materiales y procedimientos relacionados con la agregación de proteínas en enfermedades neurodegenerativas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a modelos, materiales y procedimientos relacionados con la agregación de proteínas asociadas con la enfermedad neurodegenerativa.

Antecedentes de la técnica [0002] Las afecciones de demencia como la enfermedad de Alzheimer (EA) se caracterizan frecuentemente por un acumulo progresivo de depósitos intracelulares y/o extracelulares de estructuras de naturaleza proteica como placas º-amiloides y ovillos neurofibrilares en los cerebros de los pacientes afectados. El aspecto de estas lesiones se correlaciona en gran medida con la degeneración neurofibrilar patológica y la atrofia cerebral así como con el deterioro cognitivo (Mukaetova-Ladinska, E.B. y col (2000) Am. J. Pathol. Vol. 157, Nº 2, 623 - 636) .

Tanto las placas neuríticas como los ovillos neurofibrilares contienen filamentos helicoidales apareados (FHA) de los cuales es un constituyente principal la proteína asociada a microtúbulos tau (Wischik y col., (1988) PNAS USA 85, 4506) . Las placas también contienen fibrillas º-amiloides extracelulares derivadas del procesamiento anómalo de la proteína precursora del amiloide (PPA, Kang y col., (1987) Nature 325, 733) . En un artículo de Wischik y col. (en "Neurobiology of Alzheimer's Disease", 2ª Edición (2000) Eds. Dawbarn, D. y Allen, S.J., The Molecular and Cellular Neurobiology Series, Bios Scientific Publishers, Oxford) se discute en detalle el posible papel de la proteína tau en la patogénesis de las demencias neurodegenerativas.

Los estudios de la enfermedad de Alzheimer indican que la pérdida de la forma normal de tau (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) Am. J. Pathol., 143, 565; Wischik y col. (1995a) Neurobiol. Ageing, 16: 409; Lai y col. (1995b) Neurobiol. Ageing, 16: 433) , la acumulación de FHA patológica (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) , loc. cit.; Harrington y col. (1994a) Dementia, 5, 215; Harrington y col. (1994b) Am. J. Pathol., 145, 1472; Wischik y col., (1995a) , loc. cit.) y la pérdida de sinapsis en la corteza frontal media (Terr y y col. (1991) Ann. Neurol., 30, 572) se correlacionan con el deterioro cognitivo asociado. Adicionalmente, la pérdida de sinapsis (Terr y y col., loc. cit.) yla pérdida de células piramidales (Bondareff y col. (1993) Arch. Gen. Psychiatr y , 50: 350) se correlacionan ambas con las medidas morfométricas de la patología neurofibrilar tau-reactiva, las cuales van acompañadas, a nivel molecular, de una redistribución prácticamente total del conjunto de la proteína tau de una forma soluble a otra polimerizada (FHA) en la enfermedad de Alzheimer (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) , loc. cit.; Lai y col. (1995) , loc. cit.) .

Tau se presenta en isoformas de ayuste alternativo, que contienen tres o cuatro copias de una secuencia de repetición que se corresponde con el dominio de unión a microtúbulos (Goedert, M. y col. (1989) EMBO J. 8, 393 - 399; Goedert, M., y col. (1989) Neuron 3, 519 - 526) . Tau en los FHA se procesa proteolíticamente en un dominio central (Wischik, C.M. y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4884 - 4888; Wischik y col. PNAS USA 1988, 85:4506 - 4510) ; Novak, M., y col. (1993) EMBO J. 12, 365 - 370) que está compuesto por una versión de cambio de fase del dominio de repetición; sólo tres repeticiones están implicadas en la interacción tau-tau estable (Jakes, R., y col. (1991) EMBO J. 10, 2725 - 2729) . Una vez formados, los agregados tau similares a FHA actúan como semilla para la captura posterior y proporcionan un molde para el procesamiento proteolítico de la proteína tau de longitud completa (Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93, 11213 - 11218) .

En el transcurso de su formación y acumulación, los filamentos helicoidales apareados (FHA) se ensamblan en primer lugar para formar agregados amorfos en el citoplasma, probablemente a partir de oligómeros tau iniciales que se truncan antes, o durante, el ensamblaje de los FHA (Mena, R. y col. (1995) Acta Neuropathol. 89, 50 - 56; Mena, R., y col. (1996) Acta Neuropathol. 91, 633 - 641) . A continuación, estos filamentos forman los ovillos neurofibrilares intracelulares clásicos. En este estado, los FHA constan de un núcleo de tau truncada y una cubierta externa rizada que contiene tau de longitud completa (Wischik, C.M. y col. (1996b) en "Microtubuleassociated proteins: modifications in disease", eds. Avila, J., Brandt, R. y Kosik, K. S. (Harwood Academic Publishers, Amsterdam) págs.185 - 241) ) . El proceso de ensamblaje es exponencial, consumiendo el pool celular de tau funcional normal e induciendo la síntesis de novo de tau para recuperar el déficit (Lai, R. Y. K., y col., (1995) , Neurobiology of Ageing, Vol. 16, No. 3, 433 - 445) . Finalmente, el deterioro funcional de la neurona progresa hasta el punto de la muerte celular, dejando detrás un ovillo extracelular. La muerte celular está muy relacionada con el número de ovillos extracelulares (Wishchik y col. 2000, loc.cit) . Puesto que los ovillos se extruyen dentro del espacio extracelular, se produce una pérdida progresiva de la cubierta externa rizada de la neurona con la correspondiente pérdida de la inmunorreactividad tau N-terminal, aunque se conserva la inmunorreactividad tau asociada con el núcleo de FHA (Figura 4a; también Bondareff, W. y col., (1994) J. Neuropath. Exper. Neurol., Vol. 53, Nº 2, 158 - 164) .

El cambio de fase que se observa en el dominio de repetición de tau incorporado en los FHA sugiere que el dominio de repetición sufre un cambio de conformación inducido durante la incorporación al filamento. Durante el inicio de la enfermedad de Alzheimer, es posible que este cambio conformacional pudiera iniciarse mediante la unión de tau a un sustrato patológico, como proteínas de membranas dañadas o mutadas (véase la Figura 19a; también Wischik, C.M., y col. (1996b) en "Microtubule-associated proteins: modifications in disease", eds. Avila, J., Brandt, R. y Kosik, K. S. (Harwood Academic Publishers, Amsterdam) págs.185 - 241) ) .

En el caso de la enfermedad de Alzheimer, las terapias farmacéuticas actuales se centran en el tratamiento de los síntomas de la pérdida de transmisión colinérgica que se produce debido a la neurodegeneración (Mayeux, R. y col. (1999) New Eng. J. Med. 341, 1670 - 1679) . Sin embargo, aunque los tratamientos disponibles retrasan la progresión de la enfermedad hasta un máximo de seis a ocho meses, estos no la previenen. El descubrimiento de fármacos que podrían prevenir la agregación de tau que induce la neurodegeneración proporcionaría una estrategia más eficaz para la prolifaxis o para inhibir la progresión de la enfermedad, lo cual podría no requerir un conocimiento inmediato de los diversos acontecimientos previos que inician la agregación (figura 19b) .

Ensayos de agregación de proteínas [0009] En base al posible modelo descrito anteriormente, en el documento WO96/30766 se describe un ensayo in vitro para la agregación de tau en el que un fragmento de tau correspondiente al dominio de repetición central, que se ha absorbido a un sustrato en fase sólida, es capaz de capturar tau soluble de longitud completa y unir tau con alta afinidad. Esta asociación confiere estabilidad frente a la digestión proteolítica de las moléculas de tau agregadas. El proceso se autopropaga y puede ser bloqueado selectivamente por agentes farmacéuticos prototipo (Wischik, C.M., y col. (1996) , loc. cit.) .

Aunque el ensayo in vitro descrito en el documento WO 96/30766 permite la identificación de inhibidores o moduladores de la asociación tau-tau, los actuales inventores también han reconocido que los modelos celulares de agregación de proteínas similares a la de la enfermedad de Alzheimer podrían ser útiles. Estos modelos celulares podrían usarse tanto en la selección primaria de candidatos a moduladores de la agregación tau-tau y en la selección secundaria de compuestos ya identificados en el ensayo in vitro del documento WO 96/30766. Adicionalmente, la demostración de la agregación de tau en las células también podría ayudar a la identificación de sustratos celulares normales que estén implicados en el inicio de la agregación patológica de tau; estos sustratos podrían ser por sí solos dianas para la intervención farmacológica.

Sin embargo, numerosos artículos en los que se notificaba la expresión de diversas construcciones de tau en modelos de cultivo tisular no han conseguido mostrar la agregación (véase, p. ej., Baum, L y col. (1995) Mol. Brain Res. 34:1 - 17) .

1. Un procedimiento de inducción o modelado del estado patológico de una proteína de enfermedad por agregación (PEA) que se asocia con un estado patológico en el que la PEA se agrega patológicamente mediante una interacción de polimerización conformacional inducida, estando caracterizado el procedimiento por la fase de proporcionar una proteína de fusión localizada en la membrana que comprende

i) una porción de agregación, que deriva de la PEA, ii) una porción de localización en membrana heteróloga, en el que dicho procedimiento se realiza in vitro o se realiza en una célula cultivada o línea celular, o se realiza en un animal no humano.

2. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1 en el que la porción de agregación de la proteína de fusión deriva de la PEA y en el que la localización en la membrana de la proteína de fusión hace que el sitio de captura de alta afinidad de la proteína PEA se expone de modo que se promueve la agregación de más PEA, y la agregación patológica de la PEA en el estado patológico induce el procesamiento proteolítico de la PEA en un fragmento del dominio central.

3. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 que comprende las etapas de:

a) proporcionar la proteína de fusión, b) introducirla en una membrana.

4. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la agregación de la PEA en el estado patológico se asocia con neurodegeneración y/o demencia clínica.

5. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 4 en el que la porción de agregación comprende, o consta esencialmente, de al menos el fragmento central de la PEA.

6. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la porción que se localiza en la membrana incluye una secuencia de anclaje a la membrana y/o una secuencia de parada de la transferencia.

7. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enfermedad se selecciona entre la enfermedad de Pick, parálisis supranuclear progresiva y enfermedad de Alzheimer.

8. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la PEA es la proteína tau.

9. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 8 en el que la porción de agregación de la proteína de fusión comprende un fragmento central de tau; cuyo fragmento de tau se extiende de los aminoácido.

18. 296 .

39. 441 de la proteína tau de longitud completa mostrada en la fig. 5.

10. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 9 en el que la porción de agregación de la proteína de fusión consta de los restos de aminoácido.

29. 390.

19. 441 .

19. 390 de la proteína de longitud completa.

11. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 para la selección de una pareja de unión específica del sitio de captura de alta afinidad de la PEA; comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) proporcionar la proteína de fusión en la forma localizada en la membrana, b) poner en contacto la proteína de fusión con uno o más posibles parejas de unión, en el que dicha etapa de puesta en contacto es intracelular y la pareja de unión está presente dentro de la célula, c) determinar si la posible pareja de unión se une o no a la proteína de fusión.

12. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para inducir la agregación de moléculas de la PEA, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) proporcionar la proteína de fusión en la forma localizada en la membrana,

b) causar o permitir una interacción conformacional inducida entre la proteína de fusión y una molécula de PEA adicional que es PEA o un derivado de la misma, y c) controlar el grado de agregación de la molécula de PEA adicional.

13. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 12 en el que la membrana es una membrana celular y la agregación tiene lugar a nivel intracelular.

14. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 13 en el que la etapa a) consta de:

introducir la proteína de fusión en una célula, de modo que se localice en una membrana de una célula o introducir el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en una célula o un antecesor de la misma, de modo que la proteína de fusión se exprese en la célula y se localice en la membrana en una membrana de la célula.

15. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 14 en el que la molécula de PEA adicional es una PEA soluble de longitud completa que es nativa con respecto a la célula.

16. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 13 o en la reivindicación 14 en el que la molécula PEA adicional es heteróloga con respecto a la célula y el procedimiento comprende la etapa de introducir un ácido nucleico que codifica la molécula de PEA adicional en la célula o un antecesor de la misma, de modo que la molécula PEA adicional se exprese en la célula.

17. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 16 en el que la proteína de fusión se expresa bajo el control transcripcional de un promotor constitutivo y la molécula de PEA adicional se expresa bajo el control transcripcional de un promotor inducible en presencia del agente de inducción apropiado.

18. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 16 o en la reivindicación 17, en el que la molécula de PEA adicional es un derivado de PEA que es i) un fragmento de la PEA, ii) un mutante de la PEA o iii) una PEA soluble de longitud completa.

19. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 16 o en la reivindicación 18 en el que la molécula de PEA adicional incorpora mutaciones en la PEA que se corresponden con aquellas conocidas o que se sospechan están asociadas con la enfermedad.

20. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19 en el que la agregación se controla mediante el control de la concentración o nivel de una cualquiera de las siguientes especies: i) proteína de fusión no agregada y/o molécula de PEA adicional, ii) un agregado de la proteína de fusión y/o una molécula de PEA adicional, iii) un fragmento proteolítico de la proteína de fusión y/o molécula de PEA adicional que resulta de la agregación de la misma.

21. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 20 en el que la PEA es tau, y la agregación se controla en base al aumento de los niveles de un fragmento de tau de 18 o 25 kDa.

22. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 20 o en la reivindicación 21, en el que la etapa de control comprende el uso de un anticuerpo específico para cualquiera de i) la proteína de fusión, ii) la molécula de PEA adicional, iii) un fragmento proteolítico de la proteína de fusión y/o molécula de PEA adicional que resulta de la agregación de la misma.

23. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 22 en el que la proteína de fusión se distingue inmunológicamente de la proteína PEA adicional y la PEA es tau, y el anticuerpo se selecciona entre un anticuerpo monoclonal que i) es específico de un epítope específico humano localizado en la región entre Gly-16 y Gln-26 de tau; ii) es específico del fragmento central de tau truncado en Glu-391, iii) es específico de un epítope genérico de tau en el dominio de repetición o iv) es específico de un epítope genérico no específico de especie localizado entre la Ser-208 y la Ser-238.

24. Un procedimiento para identificar un modulador de agregación de una proteína de enfermedad por agregación (PEA) que se asocia con un estado patológico en el que la PEA se agrega patológicamente a través de una interacción de polimerización conformacional inducida, comprendiendo dicho procedimiento

a) realizar un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23 en presencia de un agente que se sospecha es capaz de modular la agregación, b) controlar el grado de agregación, y c) correlacionar el grado de agregación con la actividad moduladora del agente.

25. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 24 que se lleva a cabo intracelularmente.

26. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 25 en el que la célula es de una línea celular neuronal o una línea celular de fibroblastos.

27. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 25 en el que la célula está comprendida dentro de un animal transgénico no humano.

28. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos quimérica que codifica una proteína de fusión que se localiza en la membrana que tiene i) una porción de agregación, que deriva de una proteína de enfermedad por agregación (PEA) la cual se asocia con un estado patológico en el que la PEA se agrega patológicamente mediante una interacción de polimerización conformacional inducida, ii) una porción localizada en la membrana heteróloga.

29. Un ácido nucleico según se reivindica en la reivindicación 28 en el que la secuencia de nucleótidos quimérica incluye una secuencia 3'UTR exógena y

en la que la porción localizada en la membrana comprende una secuencia señal y, opcionalmente, secuencia que codifica un dominio de anclaje a la membrana o una secuencia de parada de transferencia.

30. Un ácido nucleico según se reivindica en la reivindicación 28 o en la reivindicación 29 en el que la porción de agregación de la secuencia de nucleótidos codifica tau o un fragmento central de tau.

31. Un ácido nucleico según se reivindica en la reivindicación 30 en el que la porción de agregación de la secuencia de nucleótidos codifica un fragmento truncado de tau que se extiende entre los aminoácido.

18. 296 .

39. 441 de la proteína de longitud completa.

32. Un ácido nucleico según se reivindica en la reivindicación 31 en el que la porción de agregación de la secuencia de nucleótidos codifica los aminoácido.

29. 390.

19. 441 .

19. 390.

33. Un proceso para producir un ácido nucleico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32 que comprende la etapa de ligar un ácido nucleico que codifica la porción de agregación a un ácido nucleico que codifica la porción localizada en la membrana heteróloga,

y en el que el ácido nucleico que codifica la porción heteróloga localizada en la membrana es parte de un vector recombinante dentro del que se inserta el ácido nucleico que codifica la porción de agregación.

34. Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32 en el que el ácido nucleico está unido de forma operativa a un promotor para la transcripción en una célula huésped.

35. Un vector según se reivindica en la reivindicación 34 en el que el promotor se selecciona entre: un promotor específico de tejido, el promotor específico de prión o el promotor de la enolasa neuroespecífica.

36. Un procedimiento que comprende la etapa de introducir el vector de la reivindicación 34 o de la reivindicación 35 dentro de una célula huésped.

37. Una célula huésped que contiene o se transforma con un vector heterólogo de la reivindicación 34 o de la reivindicación 35.

38. Un procedimiento para preparar un modelo animal no humano transgénico con aumento o aceleración patológica del estado patológico en el que una proteína de enfermedad por agregación (PEA) se agrega patológicamente, comprendiendo este procedimiento la etapa de introducir en un óvulo fertilizado del animal un vector según se reivindica en la reivindicación 34 o en la reivindicación 35.

39. Un animal transgénico no humano que incluye dentro de la mayoría de sus células un promotor unido de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que se localiza en la

membrana que contiene i) una porción de agregación, que deriva de una proteína de enfermedad por agregación (PEA) la cual se asocia con un estado patológico en el que la PEA se agrega patológicamente mediante una interacción de polimerización conformacional inducida, ii) una porción localizada en la membrana heteróloga.

40. Una muestra de células o tejido del animal de la reivindicación 39 que comprende un promotor unido de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión que se localiza en la membrana.

41. Un procedimiento, animal o muestra según una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40 en el que el animal es un roedor.

42. Una proteína de fusión aislada que es codificada por la secuencia de nucleótidos quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32.

43. Un procedimiento para obtener la proteína de la reivindicación 42, comprendiendo este método la etapa de causar o permitir la expresión de un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32 en una célula huésped adecuada.

44. Un procedimiento de inducción en el animal transgénico no humano de la reivindicación 39 de un estado patológico en el que la proteína de enfermedad por agregación (PEA) se agrega patológicamente, comprendiendo el procedimiento causar o permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión localizada en la membrana.

45. Un procedimiento para la selección de un agente para su uso como agente terapéutico, pronóstico o diagnóstico en un estado patológico en que una proteína de enfermedad por agregación (PEA) se agrega patológicamente, que comprende llevar a cabo un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 44 en presencia de un agente que se sospecha es capaz de modular la agregación.

46. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 27 o en la reivindicación 45 en el que el agente es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica.

47. Un procedimiento según se reivindica en las reivindicaciones 27, 45 o 46 en el que se determina cualquiera de los siguientes aspectos dentro del cerebro del animal:

i) el grado de procesamiento proteolítico de la PEA, ii) la capacidad del agente para disminuir la cantidad de PEA agregada que se forma, iii) la capacidad del agente para eliminar o reducir el nivel de agregado de PEA ya formado.

48. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de la reivindicaciones 44 a 47 en el que la PEA es tau y el estado patológico se corresponde con la enfermedad de Alzheimer.

49. Un animal según se reivindica en la reivindicación 39 en el que la PEA es tau y el estado patológico se corresponde con la enfermedad de Alzheimer.