Inhibidor de la Hsp90 extracelular humana seleccionado entre anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que pueden unirse a la Hsp90 extracelular humana,

para su utilización en un método para prevenir y/o tratar el cáncer o las metástasis

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los tumores malignos desprenden células, que migran a nuevos tejidos y generan tumores secundarios. El proceso de generación de tumores secundarios se denomina metástasis, proceso complejo en el cual las células tumorales colonizan lugares distantes del tumor primario. Liotta ((1986) Cancer Res. 46, 1-7) ha propuesto una hipótesis en tres etapas para el proceso de formación de metástasis: La primera etapa es la adherencia de la célula tumoral a través de los receptores de la superficie celular. A continuación, la célula tumoral anclada segrega enzimas, que pueden degradar localmente la matriz. Lo más probable es que la lisis de la matriz tenga lugar en una región altamente localizada cercana a la superficie de la célula tumoral. La tercera etapa es el desplazamiento de la célula tumoral al interior de la región de la matriz modificada mediante proteolisis. Así, la invasión de la matriz no se debe simplemente a la presión debida al crecimiento pasivo si no que necesita de mecanismos bioquímicos activos. La degradación del tejido normal circundante es una característica central de la capacidad invasora de los tumores malignos. El proceso de formación de metástasis depende de la capacidad invasora de las células tumorales. Por lo tanto, sería útil desarrollar fármacos que inhiban la capacidad invasora y, de este modo, eviten las metástasis de los tumores primarios.

Recientemente, la investigación se ha centrado en la identificación de proteínas específicas involucradas en las metástasis, que pueden utilizarse como base para un mejor diagnóstico o para estrategias terapéuticas mejoradas. Una de las proteínas que se ha identificado como una molécula chaperona molecular y que es esencial para la estabilidad y función de diversas proteínas oncogénicas es la proteína de choque térmico 90 (Hsp90). Este nombre es un término genérico utilizado para describir dos isoformas denominadas Hsp90 α y β. La estructura y función de las isoformas de Hsp90 se describe en Csermely y otros: Pharmacol. Ther. Vol. 79, 1998, nº. 2, The 90-kDa Molecular Chaperone Family: Structure, Function, and Clinical Applications. A Comprehensive Review (“La familia de chaperonas moleculares de 90 kDa: Estructura función y aplicaciones clínicas. Una revisión completa”), p. 131, p.

146. Hsp90 es una de las chaperonas más abundantes en el citoplasma de las células eucariotas y constituye aproximadamente entre el 1 y el 2% de todas las proteínas de la célula. Las funciones intracelulares de Hsp90 incluyen la estabilización de proteínas (receptores esteroideos) y la maduración de proteínas como las quinasas y otras proteínas de señalización. Hsp90 se ha implicado, sin embargo, en una amplia variedad de funciones incluyendo la estabilidad evolutiva de proteínas mutadas, reordenamientos del citoesqueleto, transporte nuclear, proliferación celular y apoptosis, degradación de proteínas, presentación de antígenos y reconocimiento de liposacáridos. Siendo muy abundante en la célula, Hsp90 también se ha relacionado con muchas enfermedades, desde el cáncer a las enfermedades autoinmunes y las enfermedades cardiovasculares. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal frente al epítopo dominante inmunológicamente LKVIRK de Hsp90 ha demostrado actividad terapéutica en un tratamiento contra las infecciones fúngicas y se ha utilizado en un ensayo clínico de la compañía Neutec bajo el nombre comercial de Mycogrip®.

También se ha demostrado que Hsp90 es secretada por las células en respuesta al estrés (Liao y otros (2000) J. Biol. Chem. 275, 189-96), pero no se ha asociado ninguna función con esta secreción.

Mientras que Hsp90 posee unas funciones intracelulares bien establecidas, las notificaciones sobre la existencia de Hsp90 extracelular y su función son escasas. Se ha observado que Hsp90 es un presentador efectivo de péptidos antigénicos a receptores de células presentadoras de antígenos. También se ha observado que es una de las cuatro proteínas asociadas con las balsas lipídicas en la superficie extracelular de las células, que se unen al lipopolisacárido e inician las respuestas intracelulares (Triantafilou y otros (2002) Trends in Immunology 23, 301-4). También se ha observado que Hsp90 se sobre-expresa en la superficie de algunas células tumorales: líneas celulares de microcitomas, melanoma y hepatoma (Ferrarini y otros (1992) Int. J. Cancer 51, 613-19). Existe la hipótesis de que la expresión de Hsp90 sobre la superficie de estas líneas celulares está relacionada a la presentación de antígenos, aunque todavía no existen evidencias claras.

En la actualidad también se está evaluando Hsp90 como diana intracelular en el desarrollo de fármacos contra el cáncer, debido a su participación en la regulación de diversas vías de señalización importantes en la determinación del fenotipo de un tumor. Se ha demostrado que la inhibición de la función de Hsp90 provoca una degradación selectiva de proteínas de señalización involucradas en la proliferación celular, regulación del ciclo celular y la apoptosis. Recientemente, se ha demostrado que diversos antibióticos conocidos (por ejemplo, la geldanamicina, el radicicol y la coumermicina A1) son inhibidores de la Hsp90, describiéndose en WO 00/53169. En este documento se propone un método de inhibición de la unión de una proteína chaperona a su cliente, proponiendo dicho método poner en contacto una chaperona con coumarina o un derivado de la coumarina. Sin embargo, las enseñanzas de WO 00/53169 se dirigen meramente a la inhibición de la proteína Hsp90 intracelular.

En la actualidad ya se están evaluando en ensayos clínicos inhibidores tales como el análogo de la geldanamicina 17-AAG, pero hay preocupación sobre la toxicidad debida a la inhibición no específica de la proteína a lo largo de todos los compartimentos celulares (Dunn (2002) J. Natl. Cancer Inst 94, 1194-5). Además, la falta de comprensión de la interacción de Hsp90 con proteínas cliente en diversos procesos de señalización celular supone riesgos potenciales de la inhibición de la Hsp90 intracelular con inhibidores tóxicos.

La determinación del papel fisiológico de una proteína es un prerrequisito para decidir si la interferencia con la función de esta proteína puede ser una posible vía para el tratamiento de una enfermedad o no. Debe tenerse en cuenta que en una situación fisiológica, es decir, en una célula tumoral de un paciente, Hsp90 actúa conjuntamente con otras proteínas, que pueden modular e interferir entre sí. Es la interacción funcional entre Hsp90 y las proteínas con las que interactúa la que determina su papel fisiológico.

También se ha notificado que Hsp90 actúa como una chaperona molecular en el transporte de proteínas transmembrana en el núcleo (Schlatter y otros (2002) Biochem. J. 362, 675-84) y se ha implicado en el flujo de salida de fármacos en las células de leucemia y de carcinoma de pulmón y ovario (Rappa y otros (2002) Oncol. Res. 12, 113-9 y Rappa, y otros (2000) Anticancer Drug Des 15, 127-34).

La presente invención demuestra por primera vez que la inhibición de la Hsp90 extracelular produce una reducción de la capacidad invasora de las células tumorales. La presente invención muestra una nueva vía para inhibir la Hsp90 extracelular mediante la cual pueden evitarse los efectos secundarios asociados con el ataque a la Hsp90 intracelular.

La presenta invención también muestra una interrelación entre la inhibición de la Hsp90 y la secreción de metaloproteasas de la matriz (MMPs). Las MMPs actúan en la invasión digiriendo la matriz extracelular colindante, lo que permite que las células migren a través de los tejidos densos. Nuestros resultados han demostrado que la Hsp90 es un elemento crítico para la invasión de las células cancerosas incrementando la secreción o actividad de las MMPs, que cuando se sobreexpresa en células de fibrosarcoma. Hemos demostrado además que la invasión dependiente de Hsp90 puede ser inhibida utilizando las moléculas de la presente invención.

La presente invención se refiere a la utilización de moléculas que interfieren con la función de la Hsp90 extracelular en células tumorales para el tratamiento de cánceres específicos. Se dan a conocer compuestos, composiciones y métodos útiles para disminuir o inhibir la capacidad invasora y/o el potencial metastásico de células tumorales específicas. Además, se da a conocer un método que permite determinar si una célula tumoral es dependiente de una Hsp90 extracelular funcional para su... [Seguir leyendo]

1. Inhibidor de la Hsp90 extracelular humana seleccionado entre anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que pueden unirse a la Hsp90 extracelular humana, para su utilización en un método para prevenir y/o tratar el cáncer o las metástasis.

2. Inhibidor, según la reivindicación 1, en el que el inhibidor trata o previene la invasión y/o el potencial metastásico de las células cancerosas.

3. Inhibidor, según la reivindicación 1, en el que el inhibidor es un anticuerpo.

4. Inhibidor, según la reivindicación 1, en el que el inhibidor es un anticuerpo monoclonal.

5. Inhibidor, según la reivindicación 1, en el que el inhibidor es un fragmento de anticuerpo.

6. Inhibidor, según la reivindicación 1, en el que el inhibidor es un fragmento de anticuerpo, seleccionado del grupo formado por scFv, dsFv, Fab', Fab, F(ab')2, Fv, anticuerpo de dominio único y diacuerpo.

7. Inhibidor, según la reivindicación 1, en el que el inhibidor se marca con un marcador detectable.

8. Inhibidor, según la reivindicación 1, en el que el inhibidor reduce la actividad y/o la secreción de las metaloproteasas de la matriz (MMP).

9. Utilización de un inhibidor de la Hsp90 extracelular humana para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento del cáncer o las metástasis, en la que el inhibidor se selecciona del grupo formado por anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que pueden unirse a la Hsp90 extracelular humana.

10. Utilización, según la reivindicación 9, en el que el inhibidor trata o previene la invasión y/o el potencial metastásico de las células cancerosas.

11. Utilización, según la reivindicación 9, en el que el inhibidor es un anticuerpo.

12. Utilización, según la reivindicación 9, en el que el inhibidor es un anticuerpo monoclonal.

13. Utilización, según la reivindicación 9, en el que el inhibidor es un fragmento de anticuerpo.

14. Utilización, según la reivindicación 9, en el que el inhibidor es un fragmento de anticuerpo, seleccionado del grupo formado por scFv, dsFv, Fab', Fab, F(ab')2, Fv, anticuerpo de dominio único y diacuerpo.

15. Utilización, según la reivindicación 9, en el que el inhibidor se marca con un marcador detectable.

16. Utilización, según la reivindicación 9, en el que el inhibidor reduce la actividad y/o la secreción de las metaloproteasas de la matriz (MMP).

17. Molécula de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la Hsp90 extracelular humana para su utilización en un método para prevenir y/o tratar el cáncer o las metástasis, en el que el inhibidor es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que puede unirse a la Hsp90 extracelular humana.

18. Utilización, para determinar el potencial invasor de muestras biológicas, de un kit que comprende un inhibidor, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y contenedores de análisis adecuados.

19. Utilización, según la reivindicación 18, en la que la muestra biológica incluye un cáncer.

20. Utilización, según la reivindicación 18, en la que el inhibidor está marcado.

21. Método de cribado o análisis de la invasión y/o el comportamiento metastásico de células ex vivo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto las células con uno o más inhibidores de la Hsp90 bajo condiciones que impiden la captación celular de dicho inhibidor, siendo dicho inhibidor un anticuerpo o fragmento de anticuerpo;

b) analizar la migración de las células tratadas según la etapa a); c) comparar la migración de las células según la etapa a) con células no tratadas; y d) opcionalmente determinar el porcentaje de migración en comparación con células no tratadas.

22. Método, según la reivindicación 21, en el que la etapa a) comprende además la etapa de poner en contacto las células con una matriz tipo gel bajo condiciones adecuadas para el crecimiento de las células y la etapa b) comprende la etapa de analizar la migración de las células a través de la matriz tipo gel.

23. Composición farmacéutica para su utilización en un método para prevenir y/o tratar el cáncer o las metástasis, que comprende un inhibidor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.