DNA QUE CODIFICA DP-75 Y UN PROCESO PARA SU USO.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE HIBRIDA CON SEQ ID NO : 6 O FRAGMENTOS DE DICHA SEQ BAJO CONDICIONES SEVERAS O A FRAGMENTOS DE DICHA NUEVA SECUENCIA. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN INCLUYE ENSAYOS DIAGNOSTICOS

, VECTORES DE EXPRESION, SECUENCIAS DE CONTROL, MOLECULAS ANTISENTIDO, RIBOSOMAS Y CELULAS HUESPED DESTINADAS A EXPRESAR EL POLIPEPTIDO CODIFICADO POR DICHA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO. LA INVENCION ADEMAS INCLUYE REIVINDICACIONES DE DICHA SECUENCIA POLIPEPTIDICA CODIFICADA POR DICHAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W9709715US.

Solicitante: CHIRON CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 4560 HORTON STREET,EMERYVILLE, CALIFORNIA 94608.

Inventor/es: .

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 5 de Agosto de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/47A1

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/12 (Genes que codifican proteínas animales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/70 (Hidratos de carbono; Azúcares; Sus derivados (sorbitol A61K 31/047))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/86 (Vectores virales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/18 (contra materiales animales o humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/11 (Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/577 (en los que interviene anticuerpos monoclonados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/47 (de mamíferos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)

Clasificación antigua:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/12 (Genes que codifican proteínas animales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/70 (Hidratos de carbono; Azúcares; Sus derivados (sorbitol A61K 31/047))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/86 (Vectores virales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/18 (contra materiales animales o humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/11 (Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/577 (en los que interviene anticuerpos monoclonados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/47 (de mamíferos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
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Fragmento de la descripción:

DNA que codifica DP-75 y un proceso para su uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Más específicamente, la presente invención se refiere a una secuencia de DNA y a la proteína correspondiente.

Fundamento de la invención

Una familia de proteínas que se unen a GTP y proteínas relacionadas ha estado implicada en la tumorigenicidad de células hiperproliferantes. Estas proteínas incluyen ras, dbl, ect2, lbc, ost, y TIM. Véanse, respectivamente, Boguski and McCormick, Nature 366: 643-654 (1993), Ron et al., EMBO J. 7: 2465-2473 (1988); Miki et al., Nature 362: 462-465 (1993); Toksoz et al., Oncogene 9(2): 641-628 (1994); Horii et al., EMBO J 13(20): 4776 (1994); Chan et al., Oncogene 9(4): 1057-1063 (1994). También está incluida en esta familia la proteína Tiam-1-4786. Esta proteína ha demostrado modular el potencial invasivo de una célula. Véase Habets et al., Célula 77: 537-549 (1994); Habets et al., Oncogene 10(7): 1371-1376 (1995); y Gaston et al., Nature 375: 338-340 (1995). Tiam-1 también ha sido identificada como un miembro del una familia de estimuladores de la disociación de GDP (abreviadamente GDS por la expresión inglesa Guanine Dinucleotide Stimulators) [GDP = guanine dinucleotide phosphate]. Estas proteínas activan GTPasas similares a Rho y similares a Rac. Véase también Hillier et al., EMBL sequence database zb53605.rl Soares fetal lung NbHL 19W Homo Sapiens cDNA clone 307281.

Sumario

La presente invención es un nuevo polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con la secuencia DP-75 de la SEQ ID NO:6 o su complemento a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido no es el polinucleótido que tiene la secuencia siguiente: gttctagagc gagaattcag tgtccagagt ttaacatctg ttgtcagtga ggagtgtttt tatgaaacag agagccacgg aaaatcatag tatgattcaa tccagatatg ggttaaattc ctcattttac ttttaaactg gtggtaaagt ggaaattgca. La invención también incluye valoraciones de diagnóstico, vectores de expresión, secuencias de control, moléculas antisentido, ribozimas, y células hospedantes para expresar el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico. La presente invención también incluye reivindicaciones dirigidas al polipéptido codificado por las secuencias de ácidos nucleicos, en donde dicho polipéptido exhibe al menos 20% de la actividad biológica del polipéptido codificado por la SEQ ID NO:6.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos 15 a 40 unidades monómeras (meros) de oligonucleótidos antisentido capaces de hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia de formamida al 50% y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona:

- Un método para detectar células hiperproliferantes en una muestra que comprende:

    (a) proporcionar un sonda de polinucleótido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 a 32ºC en presencia de formamida al 50%;
    (b) poner en contacto la sonda con los polinucleótidos de la célula de muestra bajo condiciones que permitan la formación de híbridos del polinucleótido; y
    (c) detectar los híbridos.

- Una composición que comprende el polipéptido antes descrito y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

- Un proceso para producir el polipéptido antes descrito que comprende:

    (a) proporcionar la célula hospedante antes descrita; y
    (b) cultivar dicha célula hospedante bajo condiciones que inducen la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.

- Un vector antisentido que comprende (i) un polinucleótido antisentido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia formamida al 50%; y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido antisentido.

- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido es además capaz de escindir mRNA que codifica un polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6. o que varía de la secuencia del polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6 en menos de 20 aminoácidos.

- Un vector de ribozima que comprende:

    (i) una secuencia del polinucleótido de ribozima capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%; y
    (ii) un polinucleótido que comprende a secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido de ribozima,

en donde dicho polinucleótido es además capaz de escindir dicho polinucleótido de (i).

- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido descrito anteriormente y un agente capaz de aumentar la absorción del polinucleótido.

- Un anticuerpo aislado que se une específicamente al polipéptido descrito anteriormente.

- Uso de:

el vector antisentido antes descrito, el vector de ribozima o el anticuerpo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores.

- Un método para detectar polipéptidos de DP-75 en una muestra que comprende:

    (a) proporcionar el anticuerpo antes descrito;
    (b) poner en contacto dicho anticuerpo con la muestra en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo/antígeno; y
    (c) detectar los complejos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo de transferencia de mancha, en donde DP-75 se hibridó con RNA procedente de tejido tanto canceroso como normal. La fuente de tejido canceroso incluyó material renal, del tiroides, de mama, de colon, y de la uretra.

La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de transferencia de mancha, en donde DP-75 se hibridó con RNA procedente tanto de tejido canceroso como normal. La fuente de tejido canceroso incluyó tejido de pulmón, nariz, estómago, esófago, hígado, linfoma, útero, vejiga, recto, y cerebro.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y tecnología de DNA recombinante que están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. Dichas técnicas están completamente explicadas en la literatura científica. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D.N. Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D: Hames & S. J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (BD. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (RI. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL. Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); las series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.);...

 


Reivindicaciones:

1. Un polinucleótido aislado que comprende a secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o su complemento a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido no es el polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico:


2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, que comprende un fragmento de la secuencia de SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 de una longitud entre 15 y 40 pares de bases.

3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico exhibe al menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1.

4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico exhibe al menos 99% de homología con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1.

5. El polinucleótido aislado de la reivindicación 4, que comprende la secuencia monocatenaria 5' a 3' de ácido nucleico:


6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido tiene: (a) una longitud de entre 10 y 50 bases; (b) una longitud de entre 15 y 40 bases; o (c) una longitud de entre 20 y 30 bases.

7. Un vector de expresión aislado que comprende: (1) una secuencia de control y (2) un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; en donde dicha secuencia de control está unida operativamente a dicho polinucleótido.

8. Una célula hospedante que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, en donde:

    (a) la secuencia de control es heteróloga para dicho polinucleótido y dicha secuencia de control está unida operativamente a dicho polinucleótido; o
    (b) la secuencia de control es heteróloga para dicha célula hospedante y dicha secuencia de control está unida operativamente a dicho polinucleótido.

9. La célula hospedante de la reivindicación 8, en donde dicha célula es una bacteria, una célula de levadura, una célula de mamífero o una célula de insecto.

10. La célula hospedante de la reivindicación 9, en donde la célula se selecciona de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido, células de riñón de mono, células de carcinoma hepatocelular, Campylobacter, Bacillus, Escherichia, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Aedes egypt, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni.

11. Un método para detectar células hiperproliferantes en una muestra, que comprende:

    (a) proporcionar una sonda de polinucleótido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 a 32ºC en presencia de formamida al 50%;
    (b) poner en contacto la sonda con los polinucleótidos de la célula de muestra en condiciones que permitan la formación de híbridos de polinucleótidos; y
    (c) detectar los híbridos.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la sonda tiene una longitud de entre 10 y 50 bases.

13. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polipéptido exhibe al menos 20% de la actividad biológica del polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6.

14. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde dicho polipéptido está codificado por el polinucleótido de la SEQ ID NO: 6 o varía de secuencia del polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6 en menos de 20 aminoácidos.

15. El polipéptido de la reivindicación 13 o 14 o uno de sus fragmentos o fusión, en donde dicho polipéptido exhibe un epítopo inmunológico del polipéptido codificado por el polinucleótido de la SEQ ID NO: 6.

16. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido exhibe al menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 7.

17. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde la secuencia de aminoácidos es ocho aminoácidos contigua de la SEQ ID NO: 7.

18. Una composición que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un anticuerpo aislado que específicamente se une a un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17.

20. El anticuerpo aislado de la reivindicación 19, en donde dicho anticuerpo se une específicamente a un epítopo de un polipéptido que exhibe al menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 7.

21. Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, que comprende:

    (a) proporcionar una célula hospedante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10; y
    (b) cultivar dicha célula hospedante en condiciones que induzcan la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.

22. Un vector antisentido que comprende. (i) un polinucleótido antisentido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia de formamida al 50%; y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido antisentido.

23. El vector antisentido de la reivindicación 22, que comprende además un origen de la replicación.

24. El vector antisentido de la reivindicación 22, que comprende además un polinucleótido capaz de facilitar la integración del vector en un genoma.

25. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido es además capaz de escindir el mRNA que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14.

26. Un de vector ribozima que comprende:

    (i) una secuencia de polinucleótido de ribozima capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO:1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%; y
    (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido de ribozima,

en donde dicho polinucleótido es además capaz de escindir dicho polinucleótido de (i).

27. El vector antisentido de la reivindicación 22 o el vector de ribozima de la reivindicación 26, en donde dichas secuencias para iniciar la transcripción se derivan de un retrovirus, un adenovirus, o un virus adeno-asociado.

28. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un agente capaz de potenciar la absorción del polinucleótido.

29. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, que comprende además una sal soluble en agua.

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, que comprende además un ácido grado.

31. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, en donde dicho ácido graso es aceite de sésamo.

32. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, que comprende además un éster de ácido graso sintético.

33. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, en donde dicho éster de ácido graso se selecciona del grupo que consiste en oleato de etilo y triglicéridos.

34. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, que comprende además una sustancia para aumentar la viscosidad de la composición.

35. La composición farmacéutica de la reivindicación 34, en donde dicha sustancia se selecciona de carboximetil-celulosa de sodio, sorbitol, y dextrano.

36. Uso de:

    (a) un vector antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 o 27;
    (b) un vector de ribozima de acuerdo con la reivindicación 26 o 27; o
    (c) un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19 o 20; en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores.

37. Un método para detectar polipéptidos en una muestra in vitro, que comprende:

    (a) proporcionar un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19 o 20;
    (b) poner en contacto dicho anticuerpo con la muestra en condiciones que permitan la formación complejos anticuerpo/antígeno; y
    (c) detectar los complejos.