Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida mediante el uso de pares de ARN guías.

Un método para hacer una modificación bialélica a un locus genómico diana en un genoma dentro de una célula,

que comprende:

(I) introducir en una población de células:

(a) una proteína Cas;

(b) un primer ARN guía que se hibrida con una primera secuencia de reconocimiento de ARN de CRISPR dentro del locus genómico diana;

(c) un segundo ARN guía que se hibrida con una segunda secuencia de reconocimiento de ARN de CRISPR dentro del locus genómico diana; y

(d) un vector de transformación que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado por un brazo de homología 5' que se hibrida con una secuencia diana 5' dentro del locus genómico diana y un brazo de homología 3' que se hibrida con una secuencia diana 3' dentro del locus genómico diana, en donde si la célula es un embrión en etapa de una célula el vector de transformación tiene una longitud de no más de 5 kb;

en donde el genoma comprende un par de primer y segundo cromosomas homólogos que comprenden el locus genómico diana, opcionalmente en donde la primera y segunda secuencias de reconocimiento de ARN de CRISPR flanquean la totalidad o parte de una secuencia codificante de un gen; y

en donde la proteína Cas escinde al menos una de la primera y segunda secuencias de reconocimiento de ARN de CRISPR para generar al menos una ruptura bicatenaria en cada uno del primer y segundo cromosomas homólogos, opcionalmente en donde la introducción del primer y segundo ARN guías da como resultado el aumento de la eficiencia de modificación bialélica en comparación con la introducción del primer ARN guía o el segundo ARN guía solos; y

(II) identificar una célula que comprende un locus genómico diana modificado que comprende una deleción y/o una inserción, en donde la identificación comprende realizar un ensayo cuantitativo de modificación de alelo y un ensayo de retención, en donde el ensayo de modificación de alelo comprende:

(a) un ensayo de ganancia de alelo para determinar el número de copias de una plantilla de ADN de inserto de ácido nucleico en una muestra de ADN genómico de la célula; y/o

(b) un ensayo de pérdida de alelo para determinar el número de copias en la muestra de ADN genómico de una plantilla de ADN dentro de una región del locus genómico diana reconocida para la deleción, y

en donde el ensayo de retención determina el número de copias en la muestra de ADN genómico de una plantilla de ADN de la secuencia diana 5' que se pretende retener en el locus genómico diana modificado y/o una plantilla de ADN de la secuencia diana 3' que se pretende retener en el locus genómico diana modificado,

en donde la célula no se produce mediante el uso de un proceso que involucra la modificación de la identidad genética de la línea germinal de seres humanos o que involucra el uso de un embrión humano para fines industriales o comerciales, y

en donde el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o cirugía.