Variantes de Fc con unión alterada a FcRn.

Un método para incrementar la vida media de un anticuerpo IgG humano que comprende modificar una región Fc de un anticuerpo IgG humano,

en el que dicha región Fc se modifica para sustituir una asparagina con una serina en la posición 434, en el que dicho anticuerpo IgG humano modificado es un anticuerpo IgG1, IgG2 o IgG4 y en el que la numeración es según el índice EU en Kabat et al.

Variantes de Fe con unión alterada a FcRn

La presente solicitud se refiere a variantes de ¡nmunoglobulina IgG optimizadas, a métodos de ingeniería para su generación, y a su aplicación, particularmente para propósitos terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos son proteínas inmunológicas que se unen a un antígeno específico. En la mayor parte de los mamíferos, incluyendo los seres humanos y ratones, los anticuerpos se construyen a partir de cadenas polipeptfd¡cas pesadas y ligeras emparejadas. Cada cadena está compuesta por dominios de inmunoglobulinas (Ig) individuales, y así el término genético ¡nmunoglobulina se usa para dichas proteínas. Cada cadena está compuesta por dos regiones distintas, referidas como las regiones variable y constante. Las regiones variables de la cadena ligera y pesada muestran una diversidad de secuencia significativa entre anticuerpos, y son responsables de la unión al antígeno diana. Las regiones constantes muestran menos diversidad de secuencia, y son responsables de la unión a varias proteínas naturales para incitar eventos bioquímicos importantes. En los seres humanos hay cinco clases diferentes de anticuerpos incluyendo lgA(que incluye las subclases lgA1 e lgA2), IgD, IgE, IgG (que incluye las subclases lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4), e IgM. La característica diferencial entre estas clases de anticuerpos es sus regiones constantes, aunque pueden existir diferencias sutiles en la región V. La Figura 1 muestra un anticuerpo lgG1, usado aquí como un ejemplo para describir las características estructurales generales de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos IgG son proteínas tetraméricas compuestas por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La cadena pesada de IgG está compuesta por cuatro dominios de ¡nmunoglobulina unidos desde el extremo N al C en el orden VH-CH1-CH2-CH3, en referencia al dominio variable de la cadena pesada, dominio constante 1 de cadena pesada, dominio constante 2 de cadena pesada, y dominio constante 3 de cadena pesada respectivamente (también referido como VH-CY1-Cy2-Cy3, en referencia al dominio variable de cadena pesada, dominio constante gamma 1, dominio constante gamma 2, y dominio constante gamma 3 respectivamente). La cadena ligera de IgG está compuesta por dos dominios de ¡nmunoglobulina unidos desde el extremo N al C en el orden VL-CL, en referencia al dominio variable de cadena ligera y el dominio constante de cadena ligera respectivamente.

La región variable de un anticuerpo contiene los determinantes de unión a antígeno de la molécula, y así determina la especificidad de un anticuerpo para su antígeno diana. La región variable se denomina así porque es la más distinta en secuencia de los demás anticuerpos en la misma clase. La mayor parte de la variabilidad de secuencia ocurre en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Hay 6 CDR en total, tres por cada cadena pesada y ligera, designadas VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, y VL CDR3. La región variable fuera de las CDR se refiere como la región marco (FR). Aunque no es tan diversa como las CDR, aparece variabilidad de secuencia en la región FR entre diferentes anticuerpos. Globalmente, esta arquitectura característica de los anticuerpos proporciona un soporte estable (la región FR) sobre el que el sistema inmune puede explorar una diversidad de unión a antígeno sustancial (las CDR) para obtener especificidad para una matriz amplia de antígenos. Están disponibles varias estructuras de alta resolución para una variedad de fragmentos de región variable de diferentes organismos, algunas no unidas y algunas formando un complejo con el antígeno. La secuencia y características estructurales de las regiones variables de anticuerpo están bien caracterizadas (Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279), y las características conservadas de los anticuerpos han permitido el desarrollo de una gran cantidad de técnicas de ingeniería de anticuerpos (Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376). Por ejemplo, es posible injertar las CDR de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo murino, en la región marco de otro anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo humano. Este proceso, referido en la técnica como "humanización", permite la generación de agentes terapéuticos de anticuerpo menos inmunogénicos a partir de anticuerpo no humanos. Los fragmentos que incluyen la región variable pueden existir en ausencia de otras regiones del anticuerpo, incluyendo por ejemplo el fragmento de unión a antígeno (Fab) que incluye VH-Cy1 y VH-CL, el fragmento variable (Fv) que incluye VH y VL, el fragmento variable de cadena única (scFv) que incluye VH y VL unidos entre sí en la misma cadena, así como una variedad de otros fragmentos de región variable (Little et al., 2000, Immunol Today 21:364-370).

La región Fe de un anticuerpo interacciona con varios receptores y ligandos de Fe, confiriendo un conjunto de capacidades funcionales importantes referidas como funciones efectoras. Para IgG la región Fe, como se muestra en las Figuras 1 y 2, comprende dominios Ig Cy2 y Cy3 y la bisagra N-terminal hacia Cy2. Una familia importante de receptores de Fe para la clase IgG es los receptores de Fe gamma (FcyR). Estos receptores median la comunicación entre anticuerpos y el brazo celular del sistema inmune (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). En los seres humanos, esta familia de proteínas incluye FcyRI (CD64), que incluye las isoformas FcyRIa, FcyRIb, y FcyRIc; FcyRIl (CD32), incluyendo las isoformas FcyRIIa (incluyendo los alotipos H131 y R131), FcyRIIb (incluyendo FcyRllb-1 y FcyRllb-2), y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), que incluye las isoformas FcyRIIIa (que incluye los alotipos V158 y F158) y FcyRIIIb (que incluye los alotipos FcyRIIIb- NA1 y FcyRlllb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estos receptores tienen típicamente un dominio extracelular que media la unión a Fe, una región que se extiende en la membrana, y un dominio intracelular que puede mediar algún evento de señalización en el interior de la célula. Estos receptores se expresan en una variedad de células inmunes que incluyen monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos,

plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células asesinas naturales (NK), y células T YY- La formación del complejo Fc/FcyR recluta estas células efectoras a sitios de antígeno unido, lo que resulta típicamente en eventos de señalización en el interior de las células y respuestas inmunes importantes tales como la liberación de mediadores de la inflamación, activación de células B, endocitosis, fagocitosis, y ataque citotóxico. La capacidad para mediar funciones efectoras citotóxicas y fagocíticas es un mecanismo potencial por el que los anticuerpos destruyen las células diana. La reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana se refiere como citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290,). La reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcyR reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la fagocitosis de la célula diana se refiere como fagocitosis mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCP). Se han resuelto varias estructuras de los dominios extracelulares de FcyR humanos, que incluyen FcyRIIa (código de acceso pdb 1H9V,)(Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749,) (código de acceso pdb 1 FCG)(Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442), FcyRIIb (código de acceso pdb 2FCB)(Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095- 1103); y FcyRIIIb (código de acceso pdb 1E4J)(Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273). Todos los FcyR se unen a alguna reglón en Fe, en el extremo N-terminal del dominio Cy2 y la bisagra precedente, mostrado en la Figura 1. Esta Interacción está bien caracterizada estructuralmente (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737- 749), y se han resuelto varias estructuras del Fe humano unido al dominio extracelular del FcyRIIIb humano (código de acceso pdb 1E4K)(Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273) (códigos de acceso pdb 1IIS y 1IIX)(Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477), así como se ha resuelto la estructura del complejo IgE Fc/FcsRIa humano (código de acceso pdb 1 F6A)(Garman et al., 2000, Nature 406:259-266). La respuesta de función efectora puede modificarse... [Seguir leyendo]

1. Un método para incrementar la vida media de un anticuerpo IgG humano que comprende modificar una región Fe de un anticuerpo IgG humano, en el que dicha región Fe se modifica para sustituir una asparagina con una serina en la posición 434, en el que dicho anticuerpo IgG humano modificado es un anticuerpo lgG1, lgG2 o lgG4 y en el que

la numeración es según el índice EU en Kabat et al.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que comprende una región Fe.