Variantes de FC con enlazamiento alterado a FCRN.

Un anticuerpo que comprende dos modificaciones con respecto a una región Fc humana tipo silvestre,

en donde dichas modificaciones son 428L y 434S, en donde dicho anticuerpo tiene una vida media más larga en un mamífero en comparación con un anticuerpo sin dichas modificaciones, y en donde la numeración está de acuerdo con el índice EU en Kabat et al., para uso como medicamento.

Variantes de FC con enlazamiento alterado a FCRN Campo de la invención

La presente solicitud se relaciona con variantes de inmunoglobulina IgG optimizadas, métodos de ingeniería para su generación, y su aplicación, particularmente para propósitos terapéuticos.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos son proteínas inmunológicas que se enlazan cada una a un antígeno específico. En la mayoría de los mamíferos, incluyendo humanos y ratones, los anticuerpos son construidos a partir de cadenas de polipéptidos apareadas pesadas y livianas. Cada cadena está constituida de dominios de inmunoglobulinas individuales (Ig), y así el término genérico inmunoglobulina es utilizado para tales proteínas. Cada cadena está hecha de dos regiones distintas, denominadas como regiones variable y constante. Las regiones variables de cadena liviana y pesada muestran diversidad de secuencias significativa entre anticuerpos, y son responsables por el enlazamiento al antígeno objetivo. Las regiones constantes muestran menos diversidad de secuencia, y son responsables por enlazar un número de proteínas naturales para generar importantes eventos bioquímicos. En los humanos hay cinco clases diferentes de anticuerpos incluyendo IgA, (la cual incluye la subclases lgA1 e lgA2), IgD, IgE, IgG (la cual incluye las subclases lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4), e IgM. La característica distintiva entre estas clases de anticuerpos es sus regiones constantes, aunque pueden existir diferencias más sutiles en la región V. Los anticuerpos IgG son proteínas tetraméricas compuestas de dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. La cadena pesada de IgG está compuesta de cuatro dominios de inmunoglobulina enlazados desde el terminal N a C en el orden VH-CH1-CH2-CH3, con referencia al dominio variable de cadena pesada, dominio 1 constante de cadena pesada, dominio 2 constante de cadena pesada, y dominio constante 3 de cadena pesada respectivamente (también denominadas como VH-CY1-Cy2-Cy3, con referencia al dominio variable de cadena pesada, dominio constante gamma 1, dominio constante gamma 2, y dominio constante gamma 3, respectivamente). La cadena liviana de IgG está compuesta de dos dominios de inmunoglobulina enlazados desde el terminal N a C en el orden VL-CL, con referencia al dominio variable de cadena ligera y al dominio constante de cadena ligera respectivamente.

En IgG, un sitio sobre Fe entre los dominios Cy2 y Cy3 media una interacción con el receptor neonatal FcRn. El enlazamiento a FcRn recicla anticuerpos endocitosados al esqueleto del endosoma a la corriente sanguínea (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-22; Ghetie et al., 2, Annu Rev Immunol 18:739-766). Este proceso, acoplado con la preclusión de la filtración en el riñón debida al tamaño grande de la molécula de longitud completa, da como resultado vidas medias en suero del anticuerpo favorable de una a tres semanas. El enlazamiento de Fe a FcRn también juega un papel importante en el transporte de anticuerpos. El sitio de enlazamiento sobre Fe para FcRn también es el sitio en el cual se enlazan las proteínas bacterianas A y G. El enlazamiento estrecho mediante estas proteínas se explota típicamente como un medio para purificar anticuerpos empleando cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G durante la purificación de proteínas. Así la fidelidad de esta región sobre Fe es importante tanto para las propiedades clínicas de los anticuerpos como para su purificación. Estructuras disponibles del complejo Fc/FcRn de rata (Burmeister et al., 1994, 372:379-383; Martin et al., 21, Mol Cell 7: 867-877), y de los complejos de Fe con las proteínas A y G (Deisenhofer, 1981, Biochemistry 2: 2361-237; Sauer-Eriksson et al., 1995, Structure 3:265-278; Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481), proveen una visión de la interacción de Fe con estas proteínas. El receptor de FcRn también es responsable por la transferencia de IgG a los intestinos neonatales y al lumen del epitelio intestinal en adultos (Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol., 2, 18:739-766; Yoshida et al., Immunity, 24, 2(6)769-783).

Estudios de dominios Fe de ratas y humanos han demostrado la importancia de algunos residuos de Fe para el enlazamiento de FcRn. Las secuencias de ratas y humanos tienen aproximadamente 64% de identidad de secuencia en las regiones Fe (residuos 237-443 en la numeración del índice EU). Véanse figuras 3, 4 y 5 para los alineamientos rata/humano de la cadena pesada de Fe, FcRn, y cadena liviana para los alineamientos rata/humano de Fe, cadena pesada de FcRn y cadena liviana de FcRn (beta-2-microglobulina). Se ha construido un modelo del complejo Fc/FcRn humano a partir de la estructura existente del complejo de rata Fc/FcRn (Martin et al., 21, Mol Cell 7:867-877). Las secuencias de rata y humanos comparten algunos residuos que son críticos para el enlazamiento a FcRn, tales como H31 y H435 (Madesan e al., 1997 J. Immunol. 158(5):221 -7; Shields et al., 21, J. Biol. Chem. 276(9):6591-664). En muchas posiciones, sin embargo, las proteínas humanas y de rata tienen diferentes aminoácidos, dando los residuos en la secuencia humana diferentes ambientes, y posiblemente identidades diferentes, que en la secuencia en ratas. Esta variabilidad limita la capacidad de transferir características de un homólogo al otro homólogo.

En la Fe murínica, la mutación aleatoria y la selección de despliegue de fagos en los sitios T252, T254, y T256 lleva a un mutante triple, T252L/T254S7T256F, que tiene un incremento de 3.5 repeticiones en la afinidad por FcRn y un incremento de 1.5 repeticiones en la vida media en suero (Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15(7): 637-64). La perturbación de la

interacción Fc/FcRn por mutaciones en las posiciones 253, 31 y 435 también lleva a un descenso en la vida media in vivo (Medesan et al., J. Immunol. 1997 158(5): 2211-7).

Los estudios de mutaciones en Fcy humana se han hecho en algunos de los residuos que son importantes para el enlazamiento a FcRn y han demostrado una vida media en suero incrementada. En Fcy1 humana, Hinton et al., mutaron tres residuos individualmente a los otros 19 aminoácidos comunes. Hinton et al., encontraron que algunos mutantes puntuales como un mutante doble incrementaron la afinidad de enlazamiento a FcRn (Hinton et al, 24. J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216; Hinton et al., Journal Immnulogy 26, 176: 346-356). Dos mutaciones han incrementado las vidas medias en monos. Shields et al., mutaron residuos, casi exclusivamente a Ala, y estudiaron su enlazamiento a FcRn y a las FcyR (Shields et al., 21, Biol. Chem., 276(9): 6591-664).

Dall'Acqua et al., utilizan despliegue de fagos para seleccionar mutaciones Fe que se enlazan con FcRn con afinidad incrementada (Dall'Acqua et al., 2, J. Immunol. 169: 5171-518). Las secuencias de ADN seleccionadas fueron primariamente mutantes dobles y triples. La referencia expresó las proteínas codificadas por muchas de sus secuencias seleccionadas y encontró algunas que se enlazaban a FcRn más estrechamente que la Fe tipo silvestre.

La administración de anticuerpos y proteínas de fusión Fe como agentes terapéuticos requiere inyecciones con una frecuencia prescrita relacionada con las características de eliminación y vida media de la proteína. Vidas medias más largas in vivo permiten inyecciones más escasas o dosificaciones inferiores, lo cual es claramente ventajoso. Aunque las mutaciones pasadas en el dominio Fe han llevado algunas proteínas con afinidad de enlazamiento incrementada a FcRn y vidas medias in vivo, estas mutaciones no han identificado las mutaciones óptimas y potenciado la vida media in vivo.

Una característica de la región Fe es la glicosilación conservada enlazada a N que ocurre en N297. Este carbohidrato, u oligosacárido como se denomina a veces, juega un papel estructural y funcional crítico para el anticuerpo, y es una de las razones principales de que los anticuerpos deben ser producidos utilizando sistemas de expresión de mamíferos. Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-18; Davies et al., 21, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 21, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaev et al., 21, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 21, J Biol Chem 276:6591-664; Shields et al., 22, J Biol Chem 277:26733-2674; Simmons et al., 22, J Immunol Methods 263:133-147; Radaev et al., 21, J Biol Chem 276:16469-16477; and Krapp et al., 23, J Mol Biol 325:979-989).

Se han desarrollado anticuerpos para uso terapéutico. Publicaciones representativas relacionadas con tales terapias incluyen Chamow et al., 1996, Trend Biotechnol 14: 52-6; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9: 195-2, Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2, Immunol Today 21:43-41, McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que comprende dos modificaciones con respecto a una región Fe humana tipo silvestre, en donde dichas modificaciones son 428L y 434S, en donde dicho anticuerpo tiene una vida media más larga en un mamífero en comparación con un anticuerpo sin dichas modificaciones, y en donde la numeración está de acuerdo con el índice EU en

Kabat et al., para uso como medicamento.

2. Un anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha región Fe es seleccionada del grupo consistente de: lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4.

3. Un anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo comprende una región lgG1 Fe.

4. Un anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo comprende una región lgG2 Fe.

5. Un anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual es para el tratamiento de un trastorno de un humano.

6. Un anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo tiene especificidad para un antígeno seleccionado del grupo consistente de: Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), CD25, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) e IgE.

7. Un anticuerpo para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el medicamento es para el 15 tratamiento de un trastorno seleccionado de enfermedades autoinmunes, enfermedades inmunológicas, enfermedades

infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades neurológicas, y enfermedades oncológicas y neoplásicas.

8. Un anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el trastorno es cáncer.