Variantes de Fc optimizadas.

Un polipéptido para usar en un método de tratamiento que comprende poner en contacto células efectoras que expresan Fc-RIIb con dicho polipéptido,

en donde dicho polipéptido se une con mayor afinidad al receptor Fc-RIIb que un polipéptido original y aumenta la actividad inhibidora del receptor Fc-RIIb, y en donde dicho polipéptido comprende una variante Fc de dicho polipéptido Fc original y en donde dicha variante Fc comprende una sustitución de aminoácido S267E en comparación con dicho polipéptido Fc original, en donde dicha numeración está de acuerdo con el índice de UE.

Variantes de Fc optimizadas Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevas variantes de la Fc optimizadas, particularmente métodos de modificación para su generación, y su aplicación, particularmente para fines terapéuticos.

Antecedentes de la invención Los anticuerpos son proteínas inmunológicas que se unen a un antígeno específico. En la mayoría de los mamíferos, incluyendo los seres humanos y los ratones , los antícuerpos se construyen a partír de cadenas polipeptídícas pesadas y ligeras apareadas. Cada cadena se compone de dominios de inmunoglobulina (Ig) indivíduales, y por lo tanto el término genérico inmunoglobulina se utiliza para tales proteínas. Cada cadena está compuesta de dos regiones distintas, referidas como las regiones variable y constante. Las regiones variables de cadena ligera y pesada muestran una diversidad de secuencia significativa entre los anticuerpos, y son responsables de la unión al antigeno objetivo. Las regiones constantes muestran una menor diversidad de secuencia, y son responsables de la unión de un número de proteinas naturales para inducir eventos bioquimicos importantes. En humanos existen cinco clases diferentes de anticuerpos que incluyen IgA (que incluyen las subclases IgA1 e IgA2) , IgO, IgE, IgG (que incluyen las subclases IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4) , e IgM. Las caracteristicas distintivas entre estas clases de anticuerpos son sus regiones constantes, aunque puedan existir diferencias sutiles en la región variable. La Figura 1 muestra un anticuerpo IgG1 , usado aqui como un ejemplo para describir las caracteristicas estructurales generales de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos IgG son proteinas tetraméricas compuestas por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La cadena pesada de IgG se compone de cuatro dominios de inmunoglobulinas unidos del N-al C-terminal en el orden VwCH1CH2-CH3, con referencia al dominio pesado variable, al dominio pesado constante 1, al dominio pesado constante 2 y al dominio pesado constante 3. Los dominios CH1, CH2, y CH3 de las IgG se conocen, además, como dominio constante gamma 1 (Cy1) , dominio constante gamma 2 (Cy2) y dominio constante gamma 3 (Cy3) respectivamente. La cadena ligera de la IgG se compone de dos dominios de inmunoglobulina unidos del N-al C-terminal en el orden VL-CL, en referencia al dominio variable de cadena ligera y al dominio constante de la cadena ligera, respectivamente.

La región variable de un anticuerpo contiene los determinantes de unión al antigeno de la molécula, y asi determina la especificidad de un anticuerpo por su antigeno objetivo. La región variable se nombra así porque es la más distinta en la secuencia de otros anticuerpos de la misma clase. La mayoría de la variabilidad de secuencia se produce en las regiones determinantes de la complementariedad (CORs) . Hay 6 COR en total, tres por cada cadena pesada y ligera, designadas VH COR1, VH CDR2, VH CDR3, VLCOR1, VL COR2, y VL CDR3. La región variable fuera de las COR se refiere como región marco (FR) . Aunque no son tan diversos como los CDR, la variabilidad de la secuencia sí ocurre en la región FR entre diferentes anticuerpos. En general, esta arquitectura caracteristica de los anticuerpos proporciona un andamio estable (la región FR) sobre el cual puede explorarse la diversidad de unión al antígeno sustancial (las COR) por el sistema inmune para obtener especificidad para un amplio conjunto de antígenos. Un número de estructuras de alta resolución están disponibles para una variedad de fragmentos de la región variable de diferentes organismos, algunos no unidos y algunos en complejos con el antígeno. Las características estructurales y secuencias de las regiones variables de anticuerpo están bien caracterizadas (Morea y otros, 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea y otros, 2000, Methods 20:267-279) , y las características conservadas de los anticuerpo han permitido el desarrollo de una gran cantidad de técnicas de modificación de los anticuerpos (Maynard y otros, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376) . Por ejemplo, es posible injertar las COR de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo murino, en la región marco de otro anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo humano. Este proceso, conocido en la técnica como MhumanizaciónM, permite la generación de anticuerpos terapéuticos menos inmunogénicos a partír de anticuerpos no humanos. Los fragmentos que comprenden la región variable pueden existir en la ausencia de otras regiones del anticuerpo, que incluyen por ejemplo el fragmento de unión al antigeno (Fab) que comprende VwCy1 y VwCL. el fragmento variable (Fv) que comprende VH y VL, el fragmento variable de cadena sencilla (scFv) que comprende VH y VL unidos entre sí en la misma cadena, asi como una variedad de otros fragmentos de la región variable (Little y otros, 2000, Immunol Today 21 :364-370) .

La reg ión Fc de un anticuerpo interactúa con un número de receptores y ligandos de Fc, impartiendo un conjunto de capacidades funcionales importantes referidas como funciones efectoras. Pa ra la IgG la reg ión Fe, como se muestra en la Figura 1, comprende dominios Ig Cy2 y Cy3 y la región bisagra del N-terminal que conduce a Cy2. Una familia importante de receptores Fc para la dase IgG son los receptores gamma Fc (FcyRs) . Estos receptores median la comunicación entre los anticuerpos y el brazo celular del sistema inmune. (Raghavan y otros, 1996, Annu Rev Cell Dev 6ioI 12:181-220; Ravetch y otros, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290) . En humanos esta familia de proteinas incluye FcyRI (CD64) , que incluyen las isotormas FcyRla, FcyRlb, y FcyRlc; FcyRII (CD32) , que incluyen las isoformas FcyRlla (que incluyen los alotipos H131 y R131) , FcyRllb (que incluyen FcyRllb-1 y FcyRllb-2) Y FcyRllc; Y FcyR1I1 (CD16) , que incluyen las isoformas FcyRllla (que incluyen los alotipos V158 y F158) Y FcyRlllb (que incluyen los alotipos FcyRlllbNA1 Y FcyRlllb-NA2) (Jefferis y otros, 2002, Immunol Lett 82:57-65 ) . Estos receptores tipicamente tienen un dominio extracelular que media la unión a Fc, una región que se extiende en la membrana y un dominio intracelular que puede mediar algunos eventos de señalización dentro de la célula. Estos receptores se expresan en una variedad de células inmunes que incluyen monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células asesinas naturales (N K) y células T y6. La formación del complejo FcfFcyR recluta estas células efectoras a sitios de unión al antígeno, que resultan Upicamente en eventos de señalización dentro de las células y respuestas inmunes subsecuentes importantes tales como la liberación de mediadores de la inflamación, activación de células B, endocitosis, fagocitosis y ataque citotóxico. La habilidad de mediar funciones efectoras citotóxicas y fagocíticas es un mecanismo potencial por el cual los anticuerpos destruyen las células objetivo. La reacción mediada por células en donde células citot6xicas no específicas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido sobre una célula objetivo y subsecuentemente causan la lisis de la célula objetivo se refiere como citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) (Raghavan y otros, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie y otros, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch y otros, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290) . La reacción mediada por células en donde células citotóxicas no especificas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido a una célula objetivo y subsecuentemente causan fagocitosis de la célula objetivo se refiere como fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) . Un número de estructuras se han solucionado de los dominios extracelulares de FcyRs humanos, incluyendo FcyRlla (código de acceso a pdb 1 H9V) (Sondermann y otros, 2001, J Mol BioI309:737-749) (código de acceso a pdb 1 FCG) (Maxwell y otros, 1999, Nat Struct BioI6:437-442) , FcyRllb (código de acceso a pdb 2FCB) (Sondermann y otros, 1999, Embo J 18:1095-1103) ; y FcyRlllb (código de acceso a pdb 1E4J) (Sondermann y otros, 2000, Nature 406:267-273) . Todos los FcyRs se unen a la misma región en Fc, en el extremo N-terminal del dominio Cy2 y la bisagra precedente, que se muestra en la Figura 2. Esta interacción está bien caracterizada estructuralmente (Sondermann y otros, 2001 , J Mol Biol 309:737-749) , y varias estructuras de la Fc humana unidas al dominio exlracelular de FcyRlllb humano se han resuelto (código de acceso a pdb 1 E4K) (Sondermann y otros, 2000, Nature 406:267-273) (código de acceso a pdbs 111S and 111X) (Radaev y otros, 2001, J Biol Che m 276:16469-16477) , asi como también tiene la estructura del complejo IgE FcfFCERla humano (código de acceso a pdb 1 F6A) (Garman y otros, 2000, Nature... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido para usar en un método de tratamiento Que comprende poner en contacto células efectoras que

expresa n FcyRllb con dicho polipéptido, en donde dicho polipéplido se une con mayor afinidad al receptor

5 FcyR llb que un polipéptido orig inal y aumenta la actividad inhibidora del receptor FcyRllb , y en donde dicho

polipéptido comprende una va riante Fe de dicho polipéptido Fe original y en donde dicha va riante Fe

comprende una sustitución de am inoácido S267E en comparación con dicho polipéplido Fe orig inal. en donde

dicha numeración está de acuerdo con el indice de UE.

2. Un polipéptido para usa r en un método de tratamiento que comprende poner en contacto células efectoras que

expresan FcyRllb con dicho polipéptido, en donde el polipéptido se une con mayor afinidad al receptor FcyRllb

que un polipéptido orig inal y aumenta la actividad inhibidora del receptor FcyR ll b, yen donde dicho polipéptido

comprende una va riante Fc de dicho polipéptido Fc original y en donde dicha variante Fc comprende una

sustitución de aminoácido S2670 en comparación con dicho polipéptido Fc original , en donde dicha

15 numeración está de acuerdo con el indice de UE.

3. El polipéptido para usa r de acuerdo con la reivind icación 1 o 2, en donde dicha variante de Fc tiene una

afin idad por el receptor FcyRllb que más de 5-veces mayor que la del polipéptido Fc original.

4. El polipéptido para usa r de acuerdo con la reivind icación 1 o 2, en donde dicha variante de Fc tiene una

afin idad por el receptor FcyRllb que está entre 5-veces .

30. veces mayor que la del polipéptido Fc original.

5. El polipéptido para usar de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho pOlipéptido es un anticuerpo.

25 6. El polipéptido para usar de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo

que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo quimérico.

7. El polipéptido pa ra usar de acuerdo con la reivind icación 6, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo

humanizado.

B. El polipéptido para usar de acuerdo con la reivind icación 6, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo

quimérico.

9. El polipéptido para usar de acuerdo con cualqu iera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde dicho anticuerpo

35 comprende además una glicoforma modificada.

10. El polipéptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivind icaciones 1 a 9, en donde el aumento de la

actividad inh ibidora del receptor FcyRllb se usa para trata r enfennedades autoinmunes.

". El pOlipéptido pa ra usar de acuerdo con cualqu iera de las reivind icaciones 1 a 9, en donde el aumento de la actividad inh ibidora del receptor FcyRllb se usa para trata r una enfermedad inflamatoria.

12. Un método pa ra aumentar la unión de un polipéptido Fc al receptor FcyRllb, dicho método comprende sustitu ir

en un polipéptido Fc original el aminoácido Ser en la posición 267 con el aminoácido Glu para proporcionar una

45 va riante Fc del pol ipéptido Fc orig inal, en donde dicha numeración está de acuerdo con el ind ice de UE.

13. Un método pa ra aumentar la unión de un polipéptido Fc al receptor FcyRllb, dicho método comprende sustitu ir

en un polipéptido Fc orig inal el aminoácido Ser en la posición 267 con el aminoácido Asp pa ra proporciona r una

va riante Fc del pol ipéptido Fc orig inal, en donde dicha numeración está de acuerdo con el índ ice de UE.

14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde el polipéptido es un anticuerpo.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste

en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo quimérico, y/o en donde dicho

55 anticuerpo comprende además una glicoforma modificada.

16. El método de acuerdo con cualqu iera de las reivindicaciones 12 a 15, en donde la sustitución de aminoácido se

realiza mediante la generación de un ácido nucleico que cod ifica dicha variante.