Sustratos porosos funcionales para fijación de biomoléculas.

Un sustrato (12) que comprende una microestructura microporosa que comprende politetrafluoroetileno expandido,

una capa intermedia que contiene una funcionalidad reactiva, estando depositada la capa intermedia sobre al menos una parte de dicha microestructura, y una capa funcional fijada a dicha capa intermedia,

comprendiendo dicha capa intermedia un recubrimiento sol-gel o un alcohol polivinílico,

teniendo dicha capa funcional sitios funcionales, creados por reacción de sustancias químicas funcionales con la funcionalidad de la capa intermedia, con una densidad de al menos 50 nanomoles/cm2

Sustratos porosos funcionales para fijación de biomoléculas Campo de la invención La presente invención se refiere a sustratos porosos funcionales y, más particularmente, a dichos sustratos usados en una aplicación de microserie para la detección de biomoléculas. 5

Antecedentes de la invención Debido a su capacidad de exploración de alto rendimiento, las microseries se han convertido en una herramienta esencial para la industria sanitaria y farmacéutica donde los investigadores están trabajando para diagnosticar enfermedades o descubrir nuevos fármacos. Además, las empresas de agricultura y defensa nacional están utilizando microseries para descubrir información respecto a la presencia de bacterias patógenas dañinas. Dicha 10 exploración simultánea es posible imprimiendo muchas manchas microscópicas, típicamente de 10-250 µm de tamaño, de moléculas biológicas (es decir, biomoléculas tales como fragmentos de ácido nucleico, anticuerpos, péptidos, proteínas, patógenos, células y similares) como sondas en el mismo sustrato para formar una microserie. Una microserie de alta densidad desarrollada con fines de investigación típicamente comprende entre 1.000 a 50.000 manchas de sonda dispuestas en un patrón regular predeterminado en un sustrato, conduciendo de este 15 modo a una densidad de mancha de aproximadamente 50 manchas/cm2 a 2.500 manchas/cm2. La dimensión del sustrato puede variar, pero generalmente el sustrato es de un tamaño de 2, 54 cm por 7, 62 cm .de portaobjetos de microscopio. Es crítico que la superficie del sustrato sea reactiva y capaz de unirse a biomoléculas de sonda de secuencia conocida. En uso, la microserie se hibrida con biomoléculas diana de secuencia desconocida para detectar simultáneamente la respuesta de la diana con las diferentes sondas aplicadas puntualmente sobre la 20 superficie de la serie. Típicamente, las dianas se marcan con colorantes fluorescentes y más habitualmente se usan técnicas de detección basadas en fluorescencia para cuantificar la respuesta de la biomolécula diana a las sondas después de hibridación. La respuesta cuantitativa compuesta de la diana a todas las sondas aplicadas puntualmente sobre el sustrato de microserie son los datos resultantes del experimento de microserie.

Los experimentos de microserie pueden emplearse para detectar los niveles de expresión de diversos genes o 25 proteínas para un organismo dado (es decir, ser humano, ratón, planta, bacteria, etc.) . Los genes o proteínas altamente expresados son mucho más fáciles de detectar porque su concentración en una muestra dada a menudo es la mayor. Sin embargo, cuando los niveles de expresión son bajos o las muestras son escasas, la tecnología de detección sensible y fiable se convierte en crítica. Este tipo de tecnología de detección es cada vez más importante para estudiar interacciones proteína-proteína o actividad bioquímica de proteínas ya que la concentración de 30 proteínas no puede amplificarse mediante reacciones enzimáticas tales como la reacción en cadena de la polimerasa.

Como resultado, dentro de la industria de microseries, existe una necesidad primordial de detección fiable de proteínas y/o ácidos nucleicos poco abundantes. Cuando se intenta medir de forma precisa o detectar dichos bajos niveles en un experimento de microserie, es imperativo que los investigadores empleen componentes del sistema 35 que maximicen la sensibilidad y la proporción global de señal a ruido. Pueden emplearse varios enfoques para influir en la sensibilidad y la proporción de señal a ruido y tres de los comunes son los siguientes: (1) mejora en la sensibilidad y límites de detección de dispositivos de exploración, (2) amplificación aumentada de la señal fluorescente mediante procedimientos de marcaje, y (3) el empleo de un sustrato altamente sensible. La presente invención se centra en potenciar la proporción de señal a ruido a través del empleo de un sustrato de microserie 40 altamente sensible.

Puede conseguirse un aumento en la fuerza de la señal aumentando la cantidad de sitios de unión por área unitaria (densidad de sitios funcionales) , que finalmente influye sobre la retención de las sondas biomoleculares inmovilizadas y la emisión de una señal aumentada cuando hibrida con moléculas diana marcadas de forma fluorescente. La claridad de la señal también puede potenciarse a través de una reducción de la autofluorescencia 45 inherente de los materiales y/o sistema usado para la detección. Estos enfoques finalmente influirán en la proporción de señal a ruido, aumentando la fuerza de la señal, y/o reduciendo el ruido. Se han intentado varios enfoques de la técnica previa.

Muchos procedimientos comunes usados para fabricar microseries de alta densidad usan sustratos bidimensionales de vidrio no poroso que contienen sitios funcionales para unir muestras de interés. Se prefiere el vidrio porque es 50 inerte y tiene baja autofluorescencia inherente lo que contribuye a que aporte menos ruido a la señal que se está detectando, habitualmente medida por técnicas basadas en fluorescencia. Ejemplos de dichos sustratos disponibles en el mercado son portaobjetos UltraGAPS II® (Corning Inc., Life Sciences, Oneonta, NY) , portaobjetos Nexterion® (Schott North America, Inc., Louisville, KY) , y portaobjetos Array-It® (Telechem International Inc., Sunnyvale, CA) . Un inconveniente al uso de vidrio no poroso es que la densidad de sitios funcionales es bastante baja provocando 55 señales relativamente débiles, lo que hace muy difícil detectar la muestra de interés, especialmente cuando se intentan detectar genes o proteínas de baja expresión. Este efecto puede minimizarse aumentando el volumen o concentración de la muestra de interés, sin embargo, el enfoque solamente puede emplearse si está disponible una muestra suficientemente grande. A menudo, los investigadores están muy limitados por la cantidad, concentración o volumen de una muestra dada. Un enfoque común para aumentar la densidad de sitios funcionales ha sido a través del uso de sustratos porosos para aumentar el área superficial accesible que contiene los sitios funcionales. Tanner y col. (patente de Estados Unidos 6750023) muestran un procedimiento para formar un material funcional para unir una serie de analitos biológicos o químicos aplicando una capa porosa inorgánica a una subestructura no porosa 5 inorgánica.

Se han intentado enfoques alternativos que usan polímeros orgánicos como materiales funcionales. Haddad y col. (documento WO 01/66244) muestra la preparación de series utilizando materiales funcionales no porosos texturizados creados a partir de películas poliméricas orientadas. Los polímeros orgánicos porosos también se han usado en sustratos de microserie y ejemplos de dichos materiales disponibles en el mercado son portaobjetos Vivid 10 Microarray® (Pall Corporation, East Hills, NY) y portaobjetos CAST® (Schleicher & Schuell Biosciences, Inc., Keene, NH) , que usan ambos membranas porosas de nylon.

La inversión de fase es una técnica común usada para preparar membranas microporosas a partir de polímeros orgánicos. El uso de dichas membranas como sustratos de microserie se describe en detalle en las solicitudes de patente de Estados Unidos 2003/0219816 de Solomon y col. y 2004/0157320 de Andreoli y col. Se analiza una 15 diversidad de materiales microporosos en la bibliografía, siendo el nailon y la nitrocelulosa los más comunes. El nailon produce los beneficios de que puede volverse fácilmente microporoso y tiene una afinidad natural por ADN. Asimismo, se sabe que la nitrocelulosa es eficaz para unir proteínas. En el caso de nailon y nitrocelulosa, la unión con ADN y/o proteínas depende de los grupos funcionales inherentes presentes en la estructura polimérica del nailon o nitrocelulosa. Por consiguiente, la densidad de sitios funcionales producida por estos materiales está 20 limitada. Además, el tamaño de poro de las membranas de inversión de fase puede no ser suficientemente pequeño para evitar la propagación lateral de manchas que conduce a interferencia limitando de ese modo la densidad de la serie. Otro problema común con el uso de polímeros orgánicos tales como nailon o nitrocelulosa reside en el hecho de que estos materiales poseen de forma inherente alta autofluorescencia.

Como la detección basada en fluorescencia es la técnica más comúnmente usada para cuantificar las biomoléculas 25 diana hibridadas, la alta autofluorescencia contribuye a un ruido de fondo aumentado afectando de forma adversa de ese modo a la claridad de la señal fluorescente. El uso de pigmentos tales como negro de carbono ha demostrado reducir la autofluorescencia. Como alternativa, como se muestra por Montagu (documento WO 2004/018623) , el ruido de fondo... [Seguir leyendo]

1. Un sustrato (12) que comprende una microestructura microporosa que comprende politetrafluoroetileno expandido, una capa intermedia que contiene una funcionalidad reactiva, estando depositada la capa intermedia sobre al menos una parte de dicha microestructura, y una capa funcional fijada a dicha capa intermedia, comprendiendo dicha capa intermedia un recubrimiento sol-gel o un alcohol polivinílico, 5

teniendo dicha capa funcional sitios funcionales, creados por reacción de sustancias químicas funcionales con la funcionalidad de la capa intermedia, con una densidad de al menos 50 nanomoles/cm2.

2. Un sustrato definido en la reivindicación 1, en el que dichos sitios funcionales tienen una densidad seleccionada entre al menos 100 nanomoles/cm2, al menos 250 nanomoles/cm2, al menos 500 nanomoles/cm2, o al menos 1000 nanomoles/cm2. 10

3. Un sustrato (12) definido en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una densidad de sitios funcionalizados entre 2.500 y 150.000 nanomoles/cm3.

4. Un sustrato (12) de la reivindicación 1, en el que dichos sitios funcionales están seleccionados entre al menos uno de grupos hidroxilo, grupos amina, grupos carboxilo, grupos aldehído, y grupos epóxido.

5. Un sustrato (12) de la reivindicación 1, en el que dicha capa funcional comprende organosilano. 15

6. Un sustrato (12) de la reivindicación 1, en el que dicha capa intermedia comprende recubrimiento sol-gel, y dicha capa funcional comprende organosilano.

7. Un sustrato (12) de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente biomoléculas unidas a los sitios funcionales.

8. Un sustrato (12) de la reivindicación 7, en el que dichas biomoléculas están seleccionadas entre al menos uno de 20 ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, oligonucleótidos, anticuerpos, células, enzimas, y patógenos.

9. Un sustrato (12) de la reivindicación 1, usado como componente de al menos uno de una microserie, un filtro activo, una superficie de transferencia, o un dispositivo de diagnóstico.

10. Un procedimiento de creación de un artículo funcionalizado que comprende las etapas de:

1. proporcionar un sustrato microporoso (12) que comprende politetrafluoroetileno expandido y que tiene una 25 microestructura, 2. depositar sobre al menos una parte de dicha microestructura una capa intermedia que comprende una funcionalidad reactiva, comprendiendo dicha capa intermedia un recubrimiento sol-gel o un alcohol polivinílico, 3. y fijar una capa funcional a dicha capa intermedia y hacer reaccionar sustancias químicas funcionales con la funcionalidad de la capa intermedia para crear sitios funcionales de modo que dicho artículo tenga una densidad 30 de sitios funcionales de al menos 50 nanomoles/cm2.

11. Un procedimiento definido en la reivindicación 10, que comprende adicionalmente una densidad de sitios funcionales entre 2.500 y 150.000 nanomoles/cm3.