Secuencias consenso de codificación de cánceres colorrectales humanos.

Un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal en un ser humano,

que comprende las etapas de:

determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática en el gen KRAS o su ARNm o proteína codificados, estando dicha mutación en el codón K117; identificar la muestra como cáncer colorrectal cuando se determina la mutación somática.

Secuencias consenso de codificación de cánceres colorrectales humanos Campo técnico de la invención

La presente invención está relacionada con el área de caracterización de cáncer. En particular, se refiere a cánceres de mama y colorrectal.

Antecedentes de la invención

Se acepta ampliamente que el cáncer humano es una enfermedad genética causada por una acumulación secuencial de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumor (1). Estas mutaciones específicas de tumor (es decir, somáticas) proporcionan pistas para los procesos celulares que subyacen en la tumorigénesis y han demostrado ser útiles para fines de diagnóstico y terapéuticos. Sin embargo, hasta ahora, solo se ha analizado una pequeña fracción de los genes y se desconoce el número y tipo de alteraciones responsables del desarrollo de tipos de tumores comunes (2). En el pasado, la selección de genes elegidos para análisis mutacionales en cáncer se guió por la información a partir de estudios de relación en familias propensas al cáncer, identificación de anomalías cromosómicas en tumores, o atributos funcionales conocidos de genes individuales o familias genéticas (2-4). La determinación de la secuencia del genoma humano acoplada con mejoras en la secuenciación y enfoques de bioinformática han hecho posible en la actualidad, en principio, el examen del genoma de células cancerígenas de una manera completa y sin sesgar. Tal enfoque no solamente proporciona el medio para descubrir otros genes que contribuyen a la tumorigénesis sino que también conduce a conocimientos mecanísticos que solamente son evidentes a través de una perspectiva biológica de los sistemas. Los análisis genéticos completos de los cánceres humanos podrían conducir al descubrimiento de un conjunto de genes, unidos entre sí a través de un fenotipo compartido, que apuntan a la importancia de los procesos o rutas celulares específicos.

Higinbotham et al., (Activating Point Mutation in Ki-ras Codon 63 in a Chemically Induced Rat Renal Tumor, molecular Carcinogenesis 5: 136-139 (1992)) desvelan una mutación del codón 117 de KRAS en un tumor hepático de ratón. Stanley, (Molecular aspects of Chemical Carcinogenesis: The roles of oncogenes and tumor suppressor genes, Toxicology 96 (1995) 173-194) enseña que una mutación puntual en el Codón 117 puede activar el grupo de genes Ras.

En la técnica existe una necesidad continua de identificar genes y patrones de mutaciones genéticas útiles para la Identificación y estadificación de cánceres en pacientes individuales.

Sumario de la invención

Se proporciona un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal en un ser humano. Una mutación somática en el gen KRAS o su ARNm o proteína codificada, estando dicha mutación en el codón K117, se determina en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano. La muestra se identifica como cáncer colorrectal si se determina la mutación somática.

Se proporciona un método para la estadificación de cánceres colorrectales para someter a ensayo agentes terapéuticos anticáncer candidatos o conocidos de acuerdo con la reivindicación 5.

Se proporciona otro método para la caracterización de un cáncer colorrectal en un ser humano de acuerdo con la

reivindicación 8.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1Ay 1B. Esquema de Exploraciones de Descubrimiento y Validación de Mutación.

Fig. 2. Frecuencia de mutación de grupos de genes CAN. Los genes CAN se agruparon por función usando grupos de Ontología Genética (GO), dominios INTERPRO, y bibliografía disponible. Las barras indican la fracción de tumores (35 de mama o 35 colorrectales) con al menos un gen mutado en el grupo funcional.

Fig. 3. (Fig. S1) Frecuencias de mutación del codón. Barras abiertas, codones de CCDS (n = 7.479.318 en 13.023 genes); barras de color rojo, codones afectados por mutaciones de sustitución de bases en cánceres de mama (n = 789); barras de color azul, codones afectados por mutaciones de sustitución de bases en cánceres colorrectales (0 = 669).

Fig. 4. (Fig. S2) Genes de CCDS excluidos del análisis. Ciento treinta y cuatro transcritos de 119 genes que se emparejaban muy de cerca de más de un locus genómico (círculo grande), y/o se localizaban en el cromosoma Y (círculo pequeño), se excluyeron del análisis.

Fig. 5. (Tabla 1.) Sumario de mutaciones somáticas

Fig. 6. (Tabla 2) Espectro de sustituciones de bases individuales

Fig. 7. (Tabla 3.) Clasificación funcional de genes CAN*

Fig. 8. (Tabla S1.) Cebadores usados para amplificación y secuenciación de PCR (página 1 de 1333 solamente; todas las secuencias de cebador están disponibles al público en un archivo que se puede descargar (1133427_som_tables.zip) en la página web de la revista Science ( www.sciencemag.org ) con Material de Apoyo En Línea ubicado en la página web/cgi/content/full/sci; 1133427/DC1)

Fig. 9. (Tabla S2A.) Características de las muestras de cáncer colorrectal.

Fig. 10. (Tabla S2B.) Características de las muestras de cáncer de mama.

Fig. 11. (Tabla S3.) Distribución de mutaciones en cánceres individuales.

Fig. 12. (Tabla S4.) Mutaciones somáticas identificadas en cánceres de mama o colorrectales.

Fig. 13. (Tabla S5.) Genes CAN de mama.

Fig. 14. (Tabla S6.) Genes CAN colorrectales.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han desarrollado métodos para caracterizar cánceres colorrectales sobre la base de firmas genéticas. Estas firmas comprenden uno o más genes que están mutados en un cáncer en particular. Las firmas se pueden usar como un medio de diagnóstico, de pronóstico, de identificación de metástasis, de estadificación para estudios farmacológicos, y para la asignación de un tratamiento apropiado.

De acuerdo con la presente invención, una mutación somática, se puede determinar sometiendo a ensayo ya sea un gen, ARNm (o ADNc derivado), o su proteína codificada. Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para determinar una mutación somática. El método puede implicar la determinación de la secuencia de todo o parte de un gen, ADNc, o proteína. El método puede implicar reactivos específicos de mutación tales como sondas, cebadores, o anticuerpos. El método se puede basar en amplificación, hibridación, reacciones de anticuerpo- antígeno, extensión del cebador, etc. Se puede usar cualquier técnica o método conocidos en la técnica para determinar una característica basada en la secuencia.

Las muestras para el ensayo pueden ser muestras tisulares de tejido colorrectal o fluidos corporales o productos que contienen células desprendidas o genes o ARNM o proteínas. Tales fluidos o productos incluyen heces, fluido intestinal. Preferentemente, para la muestra de ensayo y la muestra normal se usa el mismo tipo de tejido o fluido. Sin embargo, se sospecha que la muestra de ensayo tiene una posible anomalía neoplásica, mientras que no hay sospecha con respecto a la muestra normal.

Las mutaciones somáticas se determinan mediante el hallazgo de una diferencia entre una muestra de ensayo y una muestra normal de un ser humano. Este criterio elimina la posibilidad de diferencias de línea germinal que confunden el análisis. Para el cáncer colorrectal, el gen (o ADNc o proteína) a someter a ensayo es KRAS. Éste y otros genes asociados con el cáncer colorrectal se muestran en la Fig. 14. (Tabla S6).

Una mutación somática en el codón K117 es informativa. Esta y otras mutaciones se muestran en la Fig. 12 (Tabla S4).

Para someter a ensayo agentes terapéuticos candidatos, o que ya se han identificado, para determinar que pacientes y tumores serán sensibles a los agentes, se pueden usar una estadificación basándose en firmas. Se formarán uno o más grupos con una firma de mutación similar y el efecto del agente terapéutico en el grupo se compara con el efecto de los pacientes cuyos tumores no comparten la firma del grupo formado. El grupo de pacientes que no comparte la firma puede compartir una firma diferente o puede ser una población mixta de pacientes portadores de tumor cuyos tumores portan una diversidad de firmas.

La eficacia se puede determinar mediante cualquier medio convencional conocido en la técnica. Se puede usar cualquier índice de eficacia. El índice puede ser esperanza de vida, periodos de remisión libre de enfermedad, contracción del tumor, parada del crecimiento tumoral, mejora de la calidad de vida, disminución de efectos secundarios, disminución del dolor, etc. Se puede usar cualquier medida útil de la salud y bienestar del paciente. Además, se puede realizar ensayo in vitro en células tumorales... [Seguir leyendo]

1. Un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal en un ser humano, que comprende las etapas de:

determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática en el gen KRAS o su ARNm o proteína codificados, estando dicha mutación en el codón K117; identificar la muestra como cáncer colorrectal cuando se determina la mutación somática.

2. El método de la reivindicación 1 en el que la mutación es K117N.

3. El método de la reivindicación 1 en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido colorrectal o una metástasis sospechosa de cáncer colorrectal.

4. El método de la reivindicación 1 en el que la muestra normal es una muestra de tejido colorrectal.

5. Un método para estratificar cánceres colorrectales para someter a ensayo agentes terapéuticos anticáncer candidatos o conocidos, que comprende las etapas de:

determinar, en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática en el gen KRAS o su ARNm o proteína codificados, estando dicha mutación en el codón K 117; formar un primer grupo de cánceres colorrectales que tienen la mutación somática;

comparar la eficacia de un agente terapéutico anticáncer candidato o conocido en el primer grupo con respecto a la eficacia en un segundo grupo de cánceres colorrectales que no tienen la mutación somática; identificar una mutación somática que se correlaciona con el aumento o la disminución de la eficacia del agente terapéutico anticáncer candidato o conocido con respecto a otros grupos.

6. El método de la reivindicación 5 en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido colorrectal.

7. El método de la reivindicación 5 en el que la muestra normal es una muestra de tejido colorrectal.

8. Un método para caracterizar un cáncer colorrectal en un ser humano, que comprende las etapas de:

determinar, en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática en el gen KRAS o su ARNm o proteína codificados, estando dicha mutación en el codón K117.

9. El método de la reivindicación 8 en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido colorrectal o una metástasis sospechosa de cáncer colorrectal.

10. El método de la reivindicación 8 en el que la muestra normal es una muestra de tejido colorrectal.