Secuencias consenso codificantes de cánceres de mama y colorrectales humanos.

Un procedimiento de diagnóstico de cáncer de mama en un ser humano,

que comprende las etapas de:

determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática humana en un gen ABCA3 o su ADNc o proteína codificados; e identificar la muestra como cáncer de mama cuando se determina la mutación somática.

Secuencias consenso codificantes de cánceres de mama y colorrectales humanos La presente invención se realizó usando fondos de subvención del gobierno de los Estados Unidos. Bajo el término de las subvenciones, el gobierno de los Estados Unidos conserva determinados derechos en la invención. Las subvenciones utilizadas incluyen las subvenciones NIH CA 121113, CA 43460, CA 57345, CA 62924, GM 07309, RR 017698, P30-CA43703 y CA109274 y DAMD17-03-1-0241 del Departament of Defense grant

Campo técnico de la invención La presente invención se refiere al área de caracterización del cáncer. En particular se refiere a cánceres de mama y colorrectales.

Antecedentes de la invención Es un hecho ampliamente aceptado que el cáncer humano es una enfermedad genética ocasionada por la acumulación secuencial de mutaciones en oncogenes y genes supresores tumorales (1) . Estas mutaciones específicas de tumores (es decir, somáticas) proporcionan pistas con respecto a los procesos celulares causantes de tumorigénesis y se ha demostrado que son útiles con fines de diagnóstico y terapéuticos. Sin embargo, hasta ahora, solo se ha analizado una pequeña fracción de los genes y se desconoce el número y el tipo de alteraciones sensibles al desarrollo de tipos tumorales (2) . En el pasado, las selecciones de genes seleccionados para análisis mutacional en cáncer se han guiado por la información de estudios de ligamiento en familias propensas al cáncer, identificación de anomalías cromosómicas en tumores o atributos funcionales conocidos de genes individuales o familias de genes (2-4) . Se ha encontrado que una gran cantidad de genes se sobreexpresan en cáncer [50]. Además, la sobreexpresión de transportadores ABC como ABCA3 se ha relacionado con la resistencia a fármacos en células tumorales humanas [51-53]. La determinación de la secuencia del genoma humano junto con mejoras en la secuenciación y estrategias bioinformáticas han hecho ahora que sea posible, en principio, examinar el genoma de células cancerosas de una manera exhaustiva y objetiva. Dicha estrategia no solo proporciona los medios para descubrir otros genes que contribuyen a la tumorigénesis sino que también conduce a conocimientos mecanicistas que solo son obvios a través de una perspectiva de sistemas biológicos. El análisis genético exhaustivo de cánceres humanos podría conducir al descubrimiento de un conjunto de genes, relacionados entre sí a través de un fenotipo compartido, orientado a la importancia de procesos celulares específicos o rutas específicas.

Existe una necesidad continua en la técnica de identificar genes y modelos de mutaciones génicas útiles para identificar y estratificar cánceres de pacientes individuales.

Sumario de la invención De acuerdo con una realización de la invención se proporciona un procedimiento para el diagnóstico del cáncer de mama en un ser humano. En una muestra de ensayo se determina una mutación somática en el gen ABCA3 o su ADNc codificado o proteína codificada con respecto a una muestra normal del ser humano. La muestra se identifica como cáncer de mama cuando se determina la mutación somática.

También se describe un procedimiento para el diagnóstico del cáncer colorrectal en un ser humano. En una muestra de ensayo se determina una mutación somática en un gen o su ADNc codificado o proteína codificada con respecto a una muestra normal del ser humano. El gen se selecciona del grupo que consiste en los indicados en la Figura 14 (Tabla S6) . La muestra se identifica como cáncer colorrectal si se determina la mutación somática.

Se proporciona un procedimiento para estratificar cánceres de mama para ensayar agentes terapéuticos anticancerosos candidatos o conocidos. Se determina una firma mutacional de genes CAN para un cáncer de mama determinando al menos una mutación somática en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal de un ser humano. La al menos una mutación somática está en el gen ABCA3. Se forma un primer grupo de cánceres de mama que tienen la firma mutacional de genes CAN. La eficacia de un agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido del primer grupo se compara con la eficacia de un segundo grupo de cánceres de mama que tiene una firma mutacional de genes CAN diferente. Se identifica una firma mutacional de genes CAN que se correlaciona con una eficacia aumentada o disminuida del agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido con respecto a otros grupos.

Se describe un procedimiento para estratificar cánceres colorrectales para ensayar agentes terapéuticos anticancerosos candidatos o conocidos. Se determina una firma mutacional de genes CAN para un cáncer colorrectal determinando al menos una mutación somática en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano. La al menos una mutación somática está uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en los genes indicados en la Figura 14 (Tabla S6) . Se forma un primer grupo de cánceres colorrectales que tienen la firma mutacional de genes CAN. La eficacia de agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido del primer grupo se compara con la eficacia de un segundo grupo de cánceres colorrectales que tienen una firma mutacional de genes CAN diferente. Se identifica una firma mutacional de genes CAN que se correlaciona con una eficacia aumentada o disminuida del agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido con respecto a otros grupos.

En el presente documento se describe un procedimiento para caracterizar un cáncer de mama en un ser humano. En una muestra de ensayo se determina una mutación somática en un gen o su ADNc codificado o proteína codificada con respecto a una muestra normal del ser humano. El gen se selecciona del grupo que consiste en los genes indicados en la Figura 13 (Tabla S5) .

Se describe otro procedimiento para la caracterización de un cáncer colorrectal en un ser humano. En una muestra de ensayo se determina una mutación somática en un gen o su ADNc codificado o proteína codificada con respecto a una muestra normal del ser humano. El gen se selecciona del grupo que consiste en los genes indicados en la Figura 14 (Tabla S6) .

Breve descripción de las figuras

Figura 1A y 1B. Esquema de Exploraciones de Descubrimiento y Validación de Mutaciones.

Figura 2. Frecuencia de mutación de los grupos de genes CAN. Los genes CAN se agruparon por función usando grupos de Ontología de Genes, dominios INTERPRO y bibliografía disponible. Las barras indican la fracción de tumores (35 de mama o 35 colorrectales) al menos con un gen mutado en el grupo funcional.

Figura 3. (Fig. S1) Frecuencias de mutación de codón. Barras blancas, codones CCDS (n=7.479.318 en 13.023 genes) ; barras rojas, codones afectados por mutaciones de sustituciones de bases en cánceres de mama (n=789) ; barras azules, codones afectados por mutaciones de sustituciones de bases en cánceres colorrectales (n=669) .

Figura 4. (Fig. S2) genes CCDS excluidos del análisis. Ciento treinta y cuatro transcritos de 119 genes que se emparejaban estrechamente con más de un locus genómico (círculo grande) y/o que estaban localizados en el cromosoma Y (círculo pequeño) se excluyeron del análisis.

Figura 5. (Tabla 1.) Resumen de mutaciones somáticas Figura 6. (Tabla 2) Espectro de sustituciones de una sola base Figura 7. (Tabla 3.) Clasificación funcional de genes CAN*

Figura 8. (Tabla S1) Cebadores usados para amplificación y secuenciación por PCR (página 1 solo de 1333; se dispone públicamente de todas las secuencias de cebadores en un archivo transferible (1133427_som_Tablas.zip) en el sitio web del journal Science (www.sci-encemag.org) con Material de apoyo Online localizado en la página web /cgi/content/full/sci;1133427/DC1)

Fig. 9. (Tabla S2A.) Características de las muestras de cáncer colorrectal.

Fig. 10. (Tabla S2B.) Características de las muestras de cáncer de mama.

Fig. 11. (Tabla S3.) Distribución de mutaciones en cánceres individuales.

Fig. 12. (Tabla S4.) Mutaciones somáticas identificadas en cánceres de mama o colorrectales.

Figura 13. (Tabla S5.) Genes CAN de mama.

Figura 14. (Tabla S6.) Genes CAN colorrectales.

Descripción detallada de la invención Los autores de la invención han desarrollado procedimientos para la caracterización de cánceres de mama basándose en firmas genéticas. Estas firmas comprenden el gen ABCA3 que está mutado en cáncer de mama. Las firmas pueden usarse como un medio diagnóstico, pronóstico, identificación de metástasis, estratificación para estudios farmacológicos y para asignar un tratamiento apropiado.

De acuerdo con la presente invención una mutación somática... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de diagnóstico de cáncer de mama en un ser humano, que comprende las etapas de:

determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática humana en un gen ABCA3 o su ADNc o proteína codificados; e identificar la muestra como cáncer de mama cuando se determina la mutación somática.

2. Un procedimiento para estratificar cánceres de mama para ensayar agentes terapéuticos anticancerosos candidatos o conocidos, que comprende las etapas de:

determinar una firma mutacional de genes CAN para un cáncer de mama determinando al menos una mutación somática en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal de un ser humano, en el que la al menos una mutación somática está en un gen ABCA3; formar un primer grupo de cánceres de mama que tengan la firma mutacional de genes CAN; comparar la eficacia de un agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido sobre el primer grupo con la eficacia sobre un segundo grupo de cánceres de mama que tiene una firma mutacional de genes CAN diferente; identificar una firma mutacional de genes CAN que se correlacione con una eficacia aumentada o disminuida del agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido con respecto a otros grupos.

3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que la firma mutacional de genes CAN comprende al menos 2 genes, seleccionados de la Figura 13 (Tabla S5) .

4. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido mamario, y en el que la muestra normal es una muestra de tejido mamario.

5. Un procedimiento de caracterización de un cáncer de mama en un ser humano, que comprende las etapas de:

determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática en un gen ABCA3 o su ADNc o proteína codificados.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 5 en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido mamario o una metástasis de cáncer de mama sospechosa, y en el que la muestra normal es una muestra de tejido mamario.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 5, en el que la mutación se selecciona de las mostradas en la Fig. 12 (Tabla S4) .

8. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que la al menos una mutación se selecciona de las mostradas en la Fig. 12 (Tabla S4) .

9. El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 5 en el que la mutación provoca una sustitución L290M.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 5 en el que la mutación provoca una sustitución H1069Q.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 5 en el que la mutación provoca una sustitución E801D.

Tránsito intracelular

Cuando los registros CCDS múltiples derivan del mismo gen, los cebadores de exones compartidos se enumeran con el registro CCDS con el número ordinal más bajo. Los exones codificantes mayores de 350 pb se amplificaron y se secuenciaron con pares de cebadores múltiples. Posición del extremo 5' del cebador PCR directo con respecto a la primera base del exón. indica el cebador de secuenciación universa.

5. GTAAAACGACGGCCAGT3'. Los números sin firma indican la posición del extremo 3' del cebador PCR inverso con respecto a la primera base del exón. Los signos positivos indican la posición el extremo 3' del cebador PCR inverso con respecto a la última base de este exón. El primer cebador no cumplió el criterio de calidad de que 90 % de bases en la región diana tenga una puntuación de calidad Phred de al menos 20 en tres cuartas partes de las muestra tumorales analizadas en la Exploración de Descubrimiento.

Fig. 9. Tabla S2A Características de las muestras de cáncer colorrectal

ID Edad Sexo Procedencia Localización del tumor Estado Tipo de muestra Exploración

del paciente del tejido original clinico

(años)

Co74 35 F Metástasis hepática Colon sigmoide IV Línea celular Descubrimiento

Co92 46 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Línea celular Descubrimiento

Co108 77 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Línea celular Descubrimiento

Mx22 66 F Metástasis hepática Desconocida IV Xenoinjerto Descubrimiento

Mx27 74 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Descubrimiento

Mx30 62 F Metástasis hepática Colon sigmoide IV Xenoinjerto Descubrimiento

Mx32 56 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Descubrimiento

Mx3B 67 M Metástasis hepática Recto IV Xenoinjerto Descubrimiento

Mx41 57 M Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Descubrimiento

Mx42 72 M Metástasis hepática Colon del lado izquierdo IV Xenoinjerto Descubrimiento

Mx43 72 M Metástasis hepática Colon sigmoide IV Xenoinjerto Descubrimiento

Co79 81 M Metástasis de nodulo linfático Colon del lado derecho IV Línea celular Validación

Co82 80 F Tumor colorrectal primario Colon del lado derecho IV Línea celular Validación

Co84 40 M Metástasis de nodulo linfático Colon del lado derecho III Línea celular Validación

Co94 46 M Metástasis de nodulo linfático Recto IV Línea celular Validación

Mx3 64 M Tumor colorrectal primario Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Validación

Mx8 65 M Tumor colorrectal primario Rectal IV Xenoinjerto Validación

Mx26 45 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Validación

Mx29 51 M Metástasis hepática Colon del lado izquierdo IV Xenoinjerto Validación

Mx31 50 M Metástasis hepática Recto IV Xenoinjerto Validación

Mx34 82 F Metástasis de nodulo linfático Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Validación

Mx35 57 F Metástasis pulmonar Recto IV Xenoinjerto Validación

Mx40 75 F Metástasis de nodulo linfático Colon del lado derecho III Xenoinjerto Validación

Mx45 67 F Metástasis hepática Colon transverso IV Xenoinjerto Validación

HxO05 62 F Metástasis hepática Flexura esplénica IV Xenoinjerto Validación

Hx169 68 M Metástasis hepática Recto IV Xenoinjerto Validación

Hx172 69 F Metástasis hepática Desconocida IV Xenoinjerto- Validación

HX174 73 F Metástasis hepática Colon sigmoide IV Xenoinjerto Validación

Hx185 39 F Metástasis hepática Recto Colon sigmoide IV Xenoinjerto Validación

Hx188 60 M Metástasis hepática Lado izquierdo IV Xenoinjerto Validación

Hx189 72 M Metástasis hepática Lado izquierdo IV Xenoinjerto Validación

Hx190 73 M Metástasis hepática Lado derecho IV Xenoinjerto Validación

Hx206 54 M Metástasis hepática Recto IV Xenoinjerto Validación

Hx218 56 F Metástasis hepática Lado izquierdo IV Xenoinjerto Validación

Hx219 69 M Metástasis hepática Ciego IV Xenoinjerto Validación

Hx220 83 F Metástasis hepática Lado derecho IV Xenoinjerto Validación

Hx223 45 F Metástasis hepática Recto sigmoide IV Xenoinjerto Validación

Fig. 10.Tabla S2B. Caracerísticas de las muestras de cancer de mama

ID Edad del paciente Tipo de Procedencia Estado Estado Estado Estado Tipo de muestra Exploración

(años) adenocarcinoma del tejido RE* RP* Mer-2/neu*

HCC1008 67 Ductal Nódulo linfáticoe IIA - - +++ Línea celular Descubrimiento

HCC1BS4 61 Ductal Tumor mamario primario IIA - - N/D Línea celular Descubrimiento

HCC38 SO Ductal Tumor mamario primario IIB - - - Línea celular Descubrimiento

HCC1143 52 Ductal Tumor mamario primario IIA - - - Línea celular Descubrimiento

HCC1187 41 Ductal Tumor mamario primario IIA - - - Línea celular Descubrimiento

HCC139S 43 Ductal Tumor mamario primario 1 - - - Línea celular Descubrimiento

HCC1S99 44 Ductal Tumor mamario primario IIIA - - - Línea celular Descubrimiento

HCC1837 24 Ductal Tumor mamario primario IIB - - - Línea celular Descubrimiento

HCC21S7 48 Ductal Tumor mamario primario IIIA - + ++ Línea celular Descubrimiento

HCC2218 38 Ductal Tumor mamario primario IIIA - - +++ Línea celular Descubrimiento

Hs57BT 74 Carcinosarcoma Tumor mamario primario N/D - - + Línea celular Descubrimiento

HCC2713 35 Ductal Tumor mamario primario I - N/D ++ Línea celular Validación

BB1T 51 Ductal Tumor mamario primario IIIC - - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB2T 51 Ductal Tumor mamario primario IIA + - ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB3T 56 Ductal Tumor mamario primario IIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB4T 52 Lobulillar Tumor mamario primario IIIA + + ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB5T 42 Ductal Tumor mamario primario IIIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB7T 59 Ductal Tumor mamario primario IIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB9T 47 Ductal Tumor mamario primario IIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BBIOT 55 Ductal Tumor mamario primario IIB + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB12T 58 Ductal Tumor mamario primario IIIA - - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB13T 63 Ductal Tumor mamario primario IIIC - - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB14T 74 Ductal Tumor mamario primario IIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB15T 79 Ductal Tumor mamario primario IIB + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB16T 40 Ductal Tumor mamario primario IIB + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB18T 53 Ductal Tumor mamario primario IIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB20T 83 Ductal Tumor mamario primario IIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB21T 77 Ductal Tumor mamario primario IIIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB22T SO Ductal Tumor mamario primario IIIC + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB23T 46 Ductolobulillar Tumor mamario primario IIIC + - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB24T 66 Ductal Tumor mamario primario IIA - - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB27T 46 Ductal Tumor mamario primario IIIA + - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB28T 47 Ductal Tumor mamario primario IIIA - + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB2BT 54 Ductal Tumor mamario primario IIA + - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB30T 60 Ductal Tumor mamario primario IIB - - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB31T 56 Ductal Tumor mamario primario IIIA - - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB32T 52 Ductal Tumor mamario primario IIA + - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB33T 36 Ductal Tumor mamario primario IV + + ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB34T 38 Ductolobulillar Tumor mamario primario IIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

8B3ST 67 Ductal Tumor mamario primario IV + + N/D Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB36T 60 Ductal Tumor mamario primario IIB - - ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB37T 47 Ductal Tumor mamario primario IIA + - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

B838T 39 Ductal Tumor mamario primario IIB + + ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB39T 39 Lobulillar Tumor mamario primario IIB + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB40T 43 Ductal Tumor mamario primario IIA + - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB42T 56 Ductal Tumor mamario primario IIB - - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB43T 54 Ductolobulillar Tumor mamario primario IIIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación

BB44T 46 Ductolobulillar Tumor mamario primario I + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación

*El estado del receptor de estrógenos (RE) y del receptor de progesterona (RP) se determina por inmunoestioquímica. -, negativo; +, positivo; *Estado Her-2/neu: -, negativo; +, poco positivo; ++ moderadamente positivo o +++ muy positivo; N/D, datos no disponibles

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(homocigoto)

(homocigoto)

Las posiciones genómicas son coordenadas en el documento de publicación del genoma humano 35.1UCSB de Santa Cruz mayo 2004, hg17. Las coordenadas se secuencian genómicas de las mutaciones están en la cadena codificante. Todos los cambios son heterocigotos salvo los indicados como homocigotos. g secuencia genómica; p secuencia de ADNc, s secuencia de proteína, del deleción, dup duplicación, ins. Inserción. chr cromosoma; las mutaciones en las secuencias no codificantes se anotan mediante un número intrónico precedido por IVS, comenzando con números positivos desde el sitio donante de corte y empalme G de GT y los números negativos comenzando desde el sitio aceptor de corte y empalme G del AG. FS mutación con desplazamiento de la fase de lectura; sp. Mutación en el sitio de corte y empalme; UTR, mutación en la región 5' o 3' no traducida; indel., insección en marco, deleción o cambio de duplicación que afectan a más de un solo codon. El cambio de aminoácido resultante de mutaciones en la metionina iniciadora de la traducción se indican como "desconocido".

La fracción de los 35 tumores de mama evaluados en las exploraciones de descubrimiento y valoración contiene mutaciones de los genes dividido entre el número de bases secuenciadas con éxito en ese gen (es decir, bases con puntuación de calidad Phred ≥ 20) .

La fracción de los 35 tumores colorrectales evaluada en las exploraciones de descubrimiento y valoración contiene mutaciones de los genes dividido entre el número debases secuenciadas con éxito en ese gen (es decir, bases con puntuación de calidad Phred ≥ 20) .