Vacuna molecular que lleva unida un polipéptido de chaperona del retículo endoplasmático a un antígeno.

Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión para ser usado como vacuna en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno,

en donde la molécula comprende:

(a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un polipéptido de calreticulina;

(b) opcionalmente, fusionada en fase con la primera secuencia de ácido nucleico, una secuencia de ácido nucleico conectora que codifica un péptido conector; y

(c) una segunda secuencia de ácido nucleico que está unida en fase a la primera secuencia de ácido nucleico o a la secuencia de ácido nucleico conectora y que codifica un polipéptido o péptido antigénico.

Vacuna molecular que lleva unida un polipéptido de chaperona del retículo endoplasmático a un antígeno Antecedentes de la invención Campo de la invención Esta invención, del campo de la inmunología y de la medicina, da a conocer composiciones para ser usadas como una vacuna en un procedimiento para inducir respuestas inmunitarias específicas de antígeno (realzadas) , en particular las mediadas por los linfocitos T citotóxicos (LTC) , mediante el uso de moléculas de ácido nucleico quiméricas o híbridas que codifican el polipéptido de chaperona del retículo endoplasmático, la calreticulina, y un antígeno peptídico o polipeptídico. Se dan a conocer vacunas con replicones de ARN autorreplicante y con ADN desnudo.

Descripción de la técnica anterior

Las vacunas con ADN se han convertido en una estrategia atractiva para inducir la inmunoterapia específica de antígeno. Las formas de las vacunas con ADN incluyen ADN «desnudo», tal como el ADN plasmídico (patente de los EE.UU. n.º 5.580.859, 5.589.466, 5.703.055) , ADN vírico y similares. Básicamente se administra a un individuo una molécula de ADN que codifica una proteína o péptido inmunógeno deseado y la proteína se genera in vivo. El uso de vacunas con ADN «desnudo» tiene las ventajas de ser seguro porque, p. ej., el plásmido en sí es poco inmunógeno, se puede preparar con facilidad con gran pureza y, en comparación a las proteínas u otros reactivos biológicos, es muy estable. Sin embargo, las vacunas con ADN tienen una potencia limitada. Se han aplicado varias estrategias para incrementar la potencia de las vacunas con ADN, entre ellas, p. ej., actuar selectivamente sobre antígenos para que se degraden rápidamente dentro de la célula; dirigir antígenos a las células presentadoras de antígeno (CPA) mediante la fusión a ligandos de los receptores de las CPA; fusión de antígenos a quimiocinas o a secuencias patógenas antigénicas, coinyección con citocinas o moléculas coestimuladoras o composiciones adyuvantes.

Las vacunas contra el cáncer son una estrategia atractiva para el tratamiento del cáncer porque pueden tener la capacidad de erradicar el tumor sistémico en muchos sitios del organismo y la especificidad de discriminar entre las células neoplásicas y las que no son neoplásicas (Pardoll (1998) Nature Med. 4: 525-531) . Los efectos antitumorales del sistema inmunitario están mediados principalmente por la inmunidad celular. El componente del sistema inmunitario mediado por las células está equipado con muchos mecanismos efectores capaces de erradicar los tumores, y la mayoría de estas respuestas inmunitarias antitumorales están reguladas por los linfocitos T. Por lo tanto, se espera que, para controlar los tumores, se desarrollen las vacunas contra el cáncer, en particular como vacunas con ADN, con el objetivo de realzar la respuesta de linfocitos T específicos del tumor.

Las proteínas oncogénicas del VPH, E6 y E7, se coexpresan en la mayoría de los cánceres de cuello uterino asociados al VPH y son importantes para la inducción y el mantenimiento de la transformación celular. Por lo tanto, las vacunas que actúan selectivamente sobre las proteínas E6 o E7 puede que sean capaces de prevenir y tratar los cánceres de cuello uterino asociados al VPH. En una serie de vacunas contra el VPH se ha explotado la E7 del VPH-16, una proteína nuclear/citoplasmática bien caracterizada que está más conservada que la E6 en las células cancerosas asociadas al VPH.

La calreticulina (CRT) , una proteína abundante de 46 kDa que se localiza en la luz del retículo endoplasmático (RE) de la célula, muestra una actividad lectina y participa en el plegamiento y ensamblaje de las glucoproteínas nacientes. Véase, p. ej., Nash (1994) Mol. Cell. Biochem. 135: 71-78; Hebert (1997) J. Cell Biol. 139: 613-623; Vassilakos (1998) Biochemistr y 37: 3480-3490; Spiro (1996) J. Biol. Chem. 271: 11588-11594. La CRT se asocia a los péptidos transportados al interior del RE por los transportadores que están relacionados con el procesamiento de los antígenos, tal como TAP-1 y TAP-2 (Spee (1997) Eur. J. Immunol. 27: 2441-2449) . La CRT también forma complejos in vitro con los péptidos. Tras administrar los complejos a los ratones, estos desencadenaron respuestas de linfocitos T CD8+ específicos del péptido (Basu (1999) J. Exp. Med. 189: 797-802; Nair (1999) J. Immunol. 162: 6426-6432) . La CRT purificada de tumores murinos desencadenó inmunidad específica contra el tumor del cual se tomó la CRT, pero no contra un tumor con otros antígenos (Basu, véase más arriba) . Mediante la sensibilización in vitro de células dendríticas (CD) de ratón con un complejo CRT-péptido, el péptido volvió a ser presentado por las moléculas de clase I del CMH de las CD para estimular una respuesta de LTC específicos del péptido (Nair, véase más arriba) .

La CRT también tiene efectos antiangiogénicos. La CRT y un fragmento que comprende los restos aminoacídicos 1 a 180, que se ha llamado «vasostatina», son inhibidores de las células endoteliales que pueden suprimir el crecimiento tumoral (Pike (1999) Blood 94: 2461-2468) . El crecimiento tumoral y la metástasis dependen de la existencia de un riego sanguíneo adecuado. A medida que crecen los tumores, el riego sanguíneo adecuado del tejido tumoral a menudo queda garantizado por la formación de nuevos vasos, un proceso denominado angiogénesis (Folkman (1982) Ann. NY Acad. Sci. 401: 212-27; Hanahan (1996) Cell 86: 353-364) . Los agentes terapéuticos que actúan selectivamente sobre la vasculatura tumoral y la dañan pueden prevenir o retrasar el crecimiento tumoral e incluso favorecer la regresión o la inactividad.

Las vacunas con ARN autorreplicante (replicones de ARN) han emergido como una forma más potente e importante de vacunas con ácidos nucleicos. Las vacunas con replicones de ARN pueden proceder de vectores de alfavirus, tales como los vectores del virus de Sindbis (Xiong (1989) Science 243: 1188-1191) , del virus de la selva del Semliki (Ying (1999) Nature Med. 5: 823-827) o del virus de la encefalitis equina venezolana (Pushko (1997) Virology 239: 389-401) . Estas vacunas son autorreplicantes y autolimitantes, y se pueden administrar tanto como ARN o como ADN que se transcribe a continuación en replicones de ARN en las células transfectadas o in vivo (Berglund (1998) Nature Biotechnol. 16: 562-565) . El ARN autorreplicante infecta un amplio abanico de tipos celulares y permite que el antígeno de interés se exprese en gran cantidad (Huang (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7: 531-535) . Adicionalmente, el ARN autorreplicante acaba provocando la lisis de las células transfectadas porque la replicación vírica es tóxica para las células hospedadoras infectadas (Frolov (1996) J. Virol. 70: 1182-1190) . Por lo tanto, estos vectores no incrementan el problema que conllevan las vacunas con ADN desnudo sobre su integración en el genoma hospedador. Esto es particularmente importante para el desarrollo de vacunas que actúan selectivamente sobre proteínas que son potencialmente oncogénicas, tales como las proteínas E6 y E7 del VPH.

Chen (2000) Cancer Research 60: 1035-1042 demostró que la unión del antígeno E7 del virus del papiloma humano de tipo 16 (VPH-16) a la proteína 70 de choque térmico (HSP70) de Mycobacterium tuberculosis acaba reforzando la potencia de la vacuna con ADN. Otros estudios han demostrado que la inmunización con complejos de proteínas de choque térmico (HSP, por su nombre en inglés) aislados de células del tumor o infectadas con el virus son capaces de inducir unas potentes inmunidad antitumoral (Janetzki (1998) J. Immunother. 21: 269-276) o inmunidad antivírica (Heikema (1997) Immunol. Lett. 57: 69-74) . Los complejos inmunógenos HSP-péptido también se pueden reconstituir in vitro mediante la mezcla de los péptidos con las HSP (Ciupitu (1998) J. Exp. Med. 187: 685-691) . Las vacunas con proteínas basadas en las HSP también se pueden administrar mediante la fusión de los antígenos a las HSP (Suzue (1996) J. Immunol. 156: 873-879, la proteína de fusión a HSP70 desencadenó las respuestas inmunitarias celular y humoral contra la p24 del VIH-1) . Estos experimentos demuestran que 1) los complejos HSPpéptido procedentes de células tumorales o de células infectadas con el virus pueden estimular la inmunidad específica contra el virus o el tumor; 2) la especificidad de esta respuesta inmunitaria está causada por péptidos procedentes del tumor que están unidos a la HSP, y no está causada por las propias HSP; y 3) la respuesta inmunitaria se puede inducir en los ratones con el CMH bien idéntico o diferente al CMH de las HSP del donante (Przepiorka (1998) Mol. Med. Today 4: 478-484; Srivastava (1998) Immunity 8: 657-665) . Aunque estas investigaciones... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión para ser usado como vacuna en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno, en donde la molécula comprende:

(a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un polipéptido de calreticulina;

(b) opcionalmente, fusionada en fase con la primera secuencia de ácido nucleico, una secuencia de ácido nucleico conectora que codifica un péptido conector; y

(c) una segunda secuencia de ácido nucleico que está unida en fase a la primera secuencia de ácido nucleico o a la secuencia de ácido nucleico conectora y que codifica un polipéptido o péptido antigénico.

2. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido antigénico comprende un epítopo que se fija a una proteína del CMH de clase I.

3. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el epítopo tiene una longitud entre 8 restos de aminoácidos y 11 restos de aminoácidos.

4. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que:

(a) la calreticulina es la calreticulina humana;

(b) la calreticulina comprende la secuencia descrita en la figura 10B;

(c) el polipéptido de calreticulina consiste en la secuencia que va desde el resto 1 al resto 180 de la secuencia descrita en la figura 10B; o

(d) el polipéptido de calreticulina consiste en una secuencia que va desde el resto 181 al resto 417 de la secuencia descrita en la figura 10B.

5. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno es un antígeno que está presente en, o que reacciona de forma cruzada con, un epítopo de un organismo o célula patógeno, o un virus.

6. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

(a) el virus es un virus de papiloma humano;

(b) el organismo patógeno es una bacteria; o

(c) la célula patógena es una célula tumoral.

7. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 (a) , para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno es el polipéptido E7 del VPH-16 o un fragmento antigénico del mismo, preferiblemente en donde dicho antígeno es una variante no oncogénica del polipéptido E7 del VPH-16.

8. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 (c) , para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno es un antígeno asociado a tumor o específico de tumor, o cualquier epítopo antigénico del mismo, preferiblemente en donde el antígeno comprende la proteína HER2/neu o un péptido de la misma.

9. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, unida operativamente a un promotor.

10. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el promotor es un promotor que se expresa en una célula presentadora de antígeno (CPA) , preferiblemente una célula dendrítica.

11. Vector de expresión o casete para ser usado como vacuna en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno, en donde dicho vector de expresión o casete comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 operativamente unida a:

(a) un promotor; y

(b) opcionalmente, otras secuencias reguladoras que regulan la expresión del ácido nucleico en una célula eucariota.

12. Vector de expresión o casete de acuerdo con la reivindicación 11, para ser usado de acuerdo con la reivindicación 11, que es:

(a) un vector vírico o un plásmido; o

(b) un replicón de ARN autorreplicante.

13. Vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 12, para ser usado de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el replicón de ARN autorreplicante es un replicón de ARN autorreplicante del virus de Sindbis, preferiblemente SINrep5.

14. Célula para ser usada como vacuna en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno, que se ha modificado para comprender una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un casete o vector de expresión para realzar una respuesta inmunitaria específica de antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. Célula de acuerdo con la reivindicación 14, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 14, que:

(a) expresa la molécula de ácido nucleico; y/o

(b) es una CPA, preferiblemente una célula dendrítica, un queratinocito, un macrófago, un monocito, un linfocito B, un microgliocito, un astrocito o una célula endotelial activada.

16. Partícula para ser usada como vacuna en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o un casete o vector de expresión para realzar una respuesta inmunitaria específica de antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

17. Partícula de acuerdo con la reivindicación 16, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende un material adecuado para la introducción en una célula o en un animal mediante el bombardeo de partículas.

18. Partícula de acuerdo con la reivindicación 17, para ser usada de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el material es oro.

19. Composición farmacéutica para ser usada como vacuna en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, un vector de expresión o casete de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, una célula de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, o cualquier combinación de lo anterior y un excipiente farmacéutica e inmunitariamente aceptable.

20. Utilización de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, un vector de expresión o casete de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, una célula de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, para la fabricación de una vacuna que realce una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un sujeto.

21. Utilización de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la respuesta está mediada al menos en parte por anticuerpos.

22. Procedimiento para fabricar una vacuna para ser usada en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un sujeto, que comprende la manipulación ex vivo de células presentadoras de antígeno (CPA) mediante

(a) la transfección de la CPA con un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13; o

(b) estimular («sensibilizar») la CPA con un lisado celular de células transfectadas con el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13;

en donde:

(i) las CPA a manipular ex vivo son histocompatibles (compatibles según el CMH) con el sujeto y se someten a cultivo celular o se aíslan del propio sujeto; y

(ii) las CPA manipuladas son para la administración al sujeto.

23. Utilización de acuerdo con la reivindicación 20 o 21 o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el sujeto es un humano.

24. Utilización de acuerdo con la reivindicación 20 o 21 o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el fármaco es para la administración al sujeto mediante una vía intramuscular, intradérmica o subcutánea.

25. Utilización de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el fármaco o la composición comprende la molécula de ácido nucleico, vector de expresión, casete o partícula, y el fármaco o composición es para la administración mediante inyección biolística.

26. Utilización de acuerdo con la reivindicación 20 o 21 o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el fármaco es para la administración por vía intratumoral o peritumoral.

27. Utilización de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, un vector de expresión o casete de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, una célula de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la fabricación de un fármaco que incremente el número o la actividad lítica de los LTC CD8+ específicos de un antígeno concreto en un sujeto, en donde:

(a) la molécula de ácido nucleico, vector de expresión, casete, célula o partícula comprende el antígeno seleccionado; y

(b) el antígeno seleccionado comprende un epítopo que se fija a las proteínas del CMH de clase I, y es presentado sobre la superficie celular por las proteínas del CMH de clase I.

28. Utilización de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, un vector de expresión o casete de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, una célula de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, para la fabricación de un fármaco que inhiba el crecimiento o la prevención del recrecimiento de un tumor en un sujeto, en donde la molécula de ácido nucleico, vector de expresión, casete, célula o partícula comprende uno o más epítopos específicos de tumor o asociados a tumor presentes en el tumor del sujeto.

29. Utilización de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el fármaco se ha de administrar por vía intratumoral

o peritumoral.

30. Utilización de acuerdo con la reivindicación 28 o 29, en donde el fármaco se ha de administrar antes, a la vez

o después de administrar al sujeto una segunda composición que tiene actividad antiangiogénica.

31. Utilización de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la composición antiangiogénica es angioestatina, endoestatina o TIMP-2.

32. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en donde el sujeto se ha de tratar adicionalmente con radioterapia o quimioterapia.

33. Productos que contienen una composición de acuerdo con la reivindicación 19, y una composición que tiene actividad antiangiogénica para inhibir el crecimiento o prevenir el recrecimiento de un tumor en un sujeto, en donde ambas composiciones se han de coadministrar.