Método para aislar y/o identificar células madre mesenquimales (CMM).

Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, para aislar y/o identificar,

de tejido primario, células madre mesenquimales homogéneas, mediante el cual el anticuerpo es el anticuerpo W5C5, que se produce por la línea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2813.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12170880.

Solicitante: EBERHARD-KARLS-UNIVERSITAT TUBINGEN.

Inventor/es: BUHRING, HANS-JORG, DR., LAMMERS, REINER, BATTULA,VENKATA LOKESH, GRIMM,SABRINA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K35/28 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Médula ósea; Células madre hematopoyéticas; Células madre mesenquimales de cualquier origen, p. ej. células madre derivadas de tejido adiposo.
  • A61K35/54 A61K 35/00 […] › Ovarios; Ovocitos; Ovulos, célula huevo; Embriones; Células del feto; Células germinales.
  • C07K16/28 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
  • C07K16/30 C07K 16/00 […] › de células tumorales.
  • C07K16/32 C07K 16/00 […] › contra productos de traducción de oncogenes.
  • G01N33/50 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G01N33/577 G01N 33/00 […] › en los que interviene anticuerpos monoclonados.
  • G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

PDF original: ES-2539905_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para aislar y/o identificar células madre mesenquimales (CMM)

La presente invención se refiere a un uso para aislar y/o identificar anticipadamente células madre mesenquimales homogéneas de tejido primario.

La expresión "células madre mesenquimales" (CMM) no se define uniformemente en la bibliografía. En principio hay dos tipos distintos de células: las CMM que se aíslan directamente de tejido primario no hematopoyético (por ejemplo, médula ósea, tejido adiposo, placenta) y las células que, en cultivos de estas células primarias, se diferencian en células fibroblásticas adherentes y que expresan marcadores de superficie celular, tales como CD73, CD105, CD166, pero que son negativas para el marcador de células madre hematopoyéticas CD34 y el marcador panleucocitario CD45. En general, las células generadas en cultivo se conocen como células madre mesenquimales, ya que después de este proceso poseen en sí mismo una capacidad multipotente para diferenciarse. Sin embargo, justo recientemente la International Society for Cellular Therapy ha revelado una declaración de principios recopilada con el objetivo de estandarizar la nomenclatura de estas células (Horwitz EM et al., "Clarification ofthe nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy Position Statement", Cytotherapy 2005: 7; 393-395). En esta publicación, las células de tejido primario que tienen la capacidad de formar colonias de fibroblastos en cultivo (unidades formadores de colonias de fibroblastos = UFC-F) se describen como células madre mesenquimales (CMM). En cambio, las células adherentes con morfología fibroblastoide que se generan cultivando células de tejido primario se conocen como "células estromales mesenquimales multipotentes". Sin embargo, el acrónimo "CMM" se ha conservado igualmente para estas células.

En este sentido, el documento DE 102 42 338 A1 desvela el aislamiento de células de muestras de médula ósea y su cultivo posterior, diferenciándolas de este modo en células fibroblásticas adherentes. Estas células representan células estromales mesenquimales multipotentes.

Debido a su multipotencia, es decir, a su capacidad de diferenciarse, en condiciones adecuadas in vitro e in vivo, en diferentes tejidos mesenquimales (tales como hueso, grasa, músculo, cartílago, etc.), las células madre mesenquimales ya se están usando terapéuticamente. Por tanto, las CMM aisladas, por ejemplo, de sangre de cordón umbilical, de médula ósea y de tejido adiposo, que son capaces de diferenciación, puede expandirse in vitro y diferenciarse en osteoblastos, condorcltos y mlocltos, y después usarse de nuevo in vivo, por ejemplo, para la regeneración de huesos, cartílagos, tendones y tejido adiposo, así como estroma.

Además de la capacidad de adherirse rápidamente y con estabilidad a superficies de plástico o vidrio, los fenotipos de CMM (células estromales mesenquimales multipotentes) se caracterizan por su morfología fibroblastoide y por su expresión (por ejemplo, de CD73, CD90, CD105, CD166) y/o por carecer de expresión (de CD34, CD45). Muchas de las moléculas de superficie expresadas sobre CMM también pueden encontrarse en células endoteliales y epiteliales y en células musculares. Sin embargo, por otro lado, las CMM se diferencian claramente de las células madre hematopoyéticas ya que no expresan ninguno de los marcadores hematopoyéticos específicos, tal como, por ejemplo, CD45.

Se sabe, de la técnica anterior, que las células madre mesenquimales pueden aislarse de médula ósea usando anticuerpos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (= CD271) (Quirici et al., "Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies". Exp. Hematol., 2002, 30(7): 783-791). Además, se ha descrito cómo las CMM pueden aislarse usando anticuerpos contra SFI2 (CD105), SFI3 (CD73) y SH4 (CD73) (véase Barry F. et al. "The SFI-3 and SFI-4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells", Biochem Biophys Res Commun. 2001; 289: 519-24 y Pittenger MF. et al., "Multi- lineage potential of adult human mesenchymal stem cells", Science. 1999; 284: 143-7). Sin embargo, la desventaja de los presentes marcadores es que no son específicos para CMM pero reconocen otras poblaciones celulares en médula ósea.

Por otra parte, Vogel et al. (Vogel W. et al., "Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells", Haematologica, 2003, 888: 126-133) describen el antígeno definido por el anticuerpo W8D2 como un nuevo marcador que se expresa muy heterogéneamente en CMM cultivadas.

El marcador de superficie celular CD271 ha sido hasta ahora el marcador de superficie celular más específico disponible en el comercio para el aislamiento de células madre mesenquimales. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales para este marcador se comercializan, por ejemplo, por las compañías BD PharMingen, San Diego, Estados Unidos y Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Alemania. Sin embargo, se ha puesto de manifiesto que este marcador no es selectivo para las CMM sino que también se expresa en otras células hematopoyéticas DC45 positivas. Como resultado, en un método de aislamiento con anticuerpos anti-CD271, no solo se aíslan células madre mesenquimales sino también hematopoyéticas.

En el contexto de las desventajas reconocidas de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar nuevas posibilidades para aislar, en la medida que sea posible, células madre mesenquimales (CMM) puras de tejidos primarios.

Como se reivindica en la presente invención, este objeto se consigue mediante un anticuerpo, o fragmentos funcionales del mismo, mediante el cual el anticuerpo es el anticuerpo W5C5, que se produce por la línea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), con el número DSM ACC 2813 (W5C5).

Además, el objeto se consigue mediante un método para identificar y/o aislar células madre mesenquimales homogéneas que implica las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra de células en suspensión de tejido primario que contiene células madre mesenquimales, con al menos un anticuerpo, o con un fragmento del mismo, mediante lo cual el anticuerpo es el anticuerpo W5C5, que se produce por la línea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), con el número DSM ACC 2813 (W5C5).

b) identificar y/o aislar en la muestra las células que en la etapa a) se han unido a los anticuerpos.

Además, la invención también se refiere a anticuerpos que se usan para este aislamiento/identificación de células madre mesenquimales, y que se generan a partir de la línea celular de hibridoma conocida como W5C5, que se ha depositado en el Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) de acuerdo con el Tratado de Budapest.

De esta manera, el objeto de la invención queda completamente satisfecho.

Los inventores sabían que con los anticuerpos mencionados es posible aislar subpoblaciones de CMM homogéneas ultra-puras, por ejemplo, directamente de médula ósea, y por consiguiente directamente de tejido primario. Por tanto, por ejemplo, un subconjunto de células CD271 positivas, que contenía exclusivamente CMM, fue capaz de identificarse por análisis de fluorescencia doble de un conjunto de células CD271 positivas mediante los anticuerpos como se reivindica en la invención. Únicamente la fracción positiva de anticuerpos contenía células madre mesenquimales clonogénicas, es decir, tenía la capacidad de formar UFC-F.

Como se ha mencionado anteriormente, previamente no fue posible aislar células madre mesenquimales ultra-puras de tejidos primarios. Como se ha mencionado anteriormente, en la técnica anterior, sólo se sabía cómo aislar e identificar células CMM cultivando células del tejido primario, es decir, células adherentes con morfología fibroblastoide que expresan los marcadores de superficie tales como CD73, CD105, CD166 y que se describen como células estromales mesenquimales multipotentes.

Con los anticuerpos mencionados, se dispone de nuevas herramientas para identificar CMM, ya que estos anticuerpos son específicos para antígenos que reconocen los dominios extracelulares, unidos a células, de las proteínas de la membrana plasmática que se expresan muy selectivamente en CMM. Dichos anticuerpos son por lo tanto apropiados para el direccionamiento, es decir, las células vivas pueden aislarse y posteriormente cultivarse, o las células (tumorales) pueden... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, para aislar y/o Identificar, de tejido primario, células madre mesenqulmales homogéneas, mediante el cual el anticuerpo es el anticuerpo W5C5, que se produce por la linea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2813.

2. Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, para aislar y/o identificar, de tejido primario, células madre mesenqulmales homogéneas, en el que se usa un anticuerpo que compite por el mismo antlgeno que el anticuerpo W5C5, que se produce por la línea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2813.

3. Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, para aislar y/o Identificar, de tejido primario, células madre mesenqulmales homogéneas, en el que se usa un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo W5C5, que se produce por la linea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2813.

4. El uso como se reivindica en una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tejido primario se selecciona del grupo que Incluye médula ósea, placenta, tejido adiposo.

5. Un método para aislar y/o identificar, de tejido primario, células madre mesenqulmales homogéneas, que incluye las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra de células en suspensión obtenida de tejido primario y que incluye células madre mesenquimales, con un anticuerpo, o con fragmentos funcionales del mismo, mediante lo cual el anticuerpo es el anticuerpo W5C5, que se produce por la linea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2813.

b) identificar y/o aislar aquellas células en la muestra a las que se ha unido un anticuerpo, o fragmentos del

mismo, de la etapa a).

6. Un método para aislar y/o identificar, de tejido primario, células madre mesenquimales homogéneas, que incluye las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra de células en suspensión obtenida de tejido primario y que incluye células madre mesenquimales, con un anticuerpo anti-CD271;

b) poner en contacto la muestra de la etapa a) con un anticuerpo, o con fragmentos funcionales del mismo, en el que el anticuerpo es el anticuerpo W5C5, que se produce por la línea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2813; y

c) identificar y/o aislar aquellas células en la muestra a las que se ha unido el anticuerpo de la etapa a), y un anticuerpo de la etapa b) o fragmentos funcionales del mismo.

7. El método como se reivindica en la reivindicación 6, en el que las etapas a) y b) se realizan de manera simultánea, sucesivamente o en orden inverso.

8. El método como se reivindica en una de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el tejido primario se selecciona del grupo que incluye médula ósea, placenta, tejido adiposo.

9. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo W5C5, o fragmentos funcionales del mismo, producido por la línea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mirkoorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2813.

10. Un kit que contiene al menos un anticuerpo, o fragmentos funcionales del mismo, producido a partir de la linea celular de hibridoma W5C5 que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mirkoorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2813.

11. El kit como se reivindica en la reivindicación 10, que además incluye un anticuerpo anti-CD271.

12. Células madre mesenquimales homogéneas W5C5+ obtenidas siguiendo el método como se reivindica en una de las reivindicaciones 5 a 8 para su uso como un medicamento.

13. Células madre mesenquimales homogéneas W5C5+ obtenidas siguiendo el método como se reivindica en una de las reivindicaciones 5 a 8 para su uso en el tratamiento de tejido óseo o cartilaginoso deteriorado.

14. El uso de células madre mesenquimales homogéneas W5C5+ obtenidas siguiendo el método como se reivindica en una de las reivindicaciones 5 a 8 para producir in vivo osteoblastos, condrocitos, adipocitos o fibroblastos.


 

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