Método para aislar y/o identificar células madre mesenquimales (CMM).

Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, para aislar y/o identificar,

de tejido primario, células madre mesenquimales homogéneas, mediante el cual el anticuerpo se selecciona del grupo constituido por anticuerpos dirigidos contra CD340 (HER2), contra CD140b, contra CD56, o anticuerpos W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1 o F9-3C2, que se producen por las líneas celulares de hibridoma que están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC ACC 2567 (W8B2), DSM ACC 2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK-3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2571 (W4A5), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9- 3C2).

Método para aislar y/o identificar células madre mesenquimales (CMM)

La presente Invención se refiere a un uso para aislar y/o identificar anticipadamente células madre mesenquimales homogéneas de tejido primario.

La expresión "células madre mesenquimales" (CMM) no se define uniformemente en la bibliografía. En principio hay dos tipos distintos de células: las CMM que se aíslan directamente de tejido primario no hematopoyético (por ejemplo, médula ósea, tejido adiposo, placenta) y las células que, en cultivos de estas células primarias, se diferencian en células fibroblásticas, adherentes y que expresan marcadores de superficie celular, tales como CD73, CD105, CD166, pero que son negativas para el marcador de células madre hematopoyéticas CD34 y el marcador panleucocitario CD45. En general, las células generadas en cultivo se conocen como células madre mesenquimales, ya que después de este proceso poseen en sí mismo una capacidad multipotente para diferenciarse. Sin embargo, justo recientemente la International Society for Cellular Therapy ha revelado una declaración de principios recopilada con el objetivo de estandarizar la nomenclatura de estas células (Horwltz EM ef al., "Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy Position Statement", Cytotherapy 2005: 7; 393-395). En esta publicación, las células de tejido primario que tienen la capacidad de formar colonias de fibroblastos en cultivo (unidades formadores de colonias de fibroblastos = UFC-F) se describen como células madre mesenquimales (CMM). En cambio, las células adherentes con morfología fibroblastolde que se generan cultivando células de tejido primario se conocen como "células estromales mesenquimales multipotentes". Sin embargo, el acrónimo "CMM" se ha conservado igualmente para estas células.

Debido a su multipotencia, es decir, a su capacidad de diferenciarse, en condiciones adecuadas in vitro e in vivo, en diferentes tejidos mesenquimales (tales como hueso, grasa, músculo, cartílago, etc.), las células madre mesenquimales ya se están usando terapéuticamente. Por tanto, las CMM aisladas, por ejemplo, de sangre de cordón umbilical, de médula ósea y de tejido adiposo, que son capaces de diferenciación, puede expandirse in vitro y diferenciarse en osteoblastos, condorcitos y miocitos, y después usarse de nuevo in vivo, por ejemplo, para la regeneración de huesos, cartílagos, tendones y tejido adiposo, así como estroma.

Además de la capacidad de adherirse rápidamente y con estabilidad a superficies de plástico o vidrio, los fenotipos de CMM (células estromales mesenquimales multipotentes) se caracterizan por su morfología fibroblastolde y por su expresión (por ejemplo, de CD73, CD90, CD105, CD166) y/o por carecer de expresión (de CD34, CD45). Muchas de las moléculas de superficie expresadas sobre CMM también pueden encontrarse en células endotellales y epiteliales y en células musculares. Sin embargo, por otro lado, las CMM se diferencian claramente de las células madre hematopoyéticas ya que no expresan ninguno de los marcadores hematopoyétlcos específicos, tal como, por ejemplo, CD45.

Se sabe, de la técnica anterior, que las células madre mesenquimales pueden aislarse de médula ósea usando anticuerpos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (= CD271) (Qulrlcl et al., "Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by antl-nerve growth factor receptor antlbodles". Exp. Flematol., 2002, 30(7): 783-791). Además, se ha descrito cómo las CMM pueden aislarse usando anticuerpos contra SFI2 (CD105), SH3 (CD73) y SH4 (CD73) (véase Barry F. et al. "The SH-3 and SH-4 antibodles recognlze distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells", Biochem Biophys Res Commun. 2001; 289: 519-24 y Plttenger MF. ef al., "Multl- llneage potential of adult human mesenchymal stem cells", Science. 1999; 284: 143-7). Sin embargo, la desventaja de los presentes marcadores es que no son específicos para CMM pero reconocen otras poblaciones celulares en médula ósea.

Por otra parte, Vogel ef al. (Vogel W. ef al., "Heterogenelty among human bone marrow-derlved mesenchymal stem cells and neural progenitor cells", Haematologlca, 2003, 888: 126-133) describen el antígeno definido por el anticuerpo W8D2 como un nuevo marcador que se expresa muy heterogéneamente en CMM cultivadas.

El documento DE 102 42 338 desvela el uso de un anticuerpo, o fragmentos funcionales del mismo, para el aislamiento y/o la Identificación de células madre mesenquimales homogéneas de células cultivadas mediante el cual el anticuerpo es W8D2 producido por las líneas celulares de hlbrldoma depositadas, de acuerdo con el tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mlkroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), con el número DSM ACC ACC 2813 (W5C5).

El marcador de superficie celular CD271 ha sido hasta ahora el marcador de superficie celular más específico disponible en el comercio para el aislamiento de células madre mesenquimales. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales para este marcador se comercializan, por ejemplo, por las compañías BD PharMIngen, San Diego, Estados Unidos y Miltenyl Blotec, Berglsch, Gladbach, Alemania. Sin embargo, se ha puesto de manifiesto que este marcador no es selectivo para las CMM sino que también se expresa en otras células hematopoyéticas DC45 positivas. Como resultado, en un método de aislamiento con anticuerpos anti-CD271, no solo se aíslan células madre mesenquimales sino también hematopoyéticas.

En el contexto de las desventajas reconocidas de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar nuevas posibilidades para aislar, en la medida que sea posible, células madre mesenquimales (CMM) puras de tejidos primarios.

Como se reivindica en la presente invención, este objeto se consigue mediante un anticuerpo, o fragmentos funcionales del mismo, mediante el cual el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos contra CD340 (HER2), contra CD140b, contra CD56, o anticuerpos W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1 o F9-3C2, que se producen por las líneas celulares de hibridoma que están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), con los números DSM ACC ACC 2567 (W8B2), DSM ACC 2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK- 3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2571 (W4A5), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9-3C2).

Además, el objeto se consigue mediante un método para identificar y/o aislar células madre mesenquimales homogéneas que implica las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra de células en suspensión de tejido primario que contiene células madre mesenquimales con al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, mediante lo cual el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos contra CD340 (HER2), contra CD140b, contra CD56, o anticuerpos W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1 o F9-3C2, que se producen por las líneas celulares de hibridoma que están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC ACC 2567 (W8B2), DSM ACC 2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK- 3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2571 (W4A5), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9-3C2);

b) identificar y/o aislar en la muestra las células que en la etapa a) se han unido a los anticuerpos.

Además, la Invención también se refiere a anticuerpos que se usan para este alslamiento/identificación de células madre mesenquimales, y que se generan a partir de una de las líneas celulares de hibridoma conocidas como W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1, F9-3C2 o 39D5, que se han depositado en el Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) de acuerdo con el Tratado de Budapest.

De esta manera, el objeto de la invención queda completamente satisfecho.

Los inventores sabían que con los anticuerpos mencionados es posible aislar subpoblaciones de CMM homogéneas ultra-puras, por ejemplo, directamente de médula ósea, y por consiguiente directamente de tejido primario. Por tanto, por ejemplo, un subconjunto de células CD271 positivas, que contenía exclusivamente CMM, fue capaz de identificarse por análisis de fluorescencia doble de un conjunto de células CD271 positivas mediante los anticuerpos como se reivindica en la invención. Únicamente la fracción positiva de anticuerpos contenía células madre mesenquimales clonogénicas,... [Seguir leyendo]

1. Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, para aislar y/o identificar, de tejido primario, células madre mesenqulmales homogéneas, mediante el cual el anticuerpo se selecciona del grupo constituido por anticuerpos dirigidos contra CD340 (HER2), contra CD140b, contra CD56, o anticuerpos W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1 o F9-3C2, que se producen por las líneas celulares de hlbrldoma que están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mlkroorganlsmen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC ACC 2567 (W8B2), DSM ACC 2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK-3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2571 (W4A5), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9- 3C2).

2. Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo dirigido contra CD56, es 39D5, que produce la línea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2930 (39D5).

3. Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, para aislar y/o identificar, de tejido primario, células madre mesenqulmales homogéneas, en el que se usa un anticuerpo que se une al mismo antígeno que uno de los anticuerpos W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1, F9-3C2F1, que se producen por las líneas celulares de hibridoma que están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC ACC 2567 (W8B2), DSM ACC 2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK-3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2571 (W4A5), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9-3C2).

4. Uso de un anticuerpo, o de fragmentos funcionales del mismo, para aislar y/o identificar, de tejido primario, células madre mesenqulmales homogéneas, en el que se usa un anticuerpo que se une al mismo epítopo que uno de los anticuerpos 24D2, 28D4, 39D5, o anticuerpos W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1, F9-3C2F1 que se producen por las líneas celulares de hibridoma que están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC ACC 2567 (W8B2), DSM ACC 2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK-3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2571 (W4A5), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9-3C2).

5. El uso como se reivindica en una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tejido primario se selecciona del grupo que incluye médula ósea, placenta, tejido adiposo.

6. Un método para aislar y/o identificar células madre mesenqulmales homogéneas de tejido primario, que incluye las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra de células en suspensión obtenida de tejido primario y que incluye células madre mesenqulmales, con un anticuerpo, o con fragmentos funcionales del mismo, mediante lo cual el anticuerpo se dirige contra CD340 (HER2), contra CD140b, contra CD56, o es uno de los anticuerpos W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1 o F9-3C2, que se producen por las líneas celulares de hibridoma que están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC 2567 (W8B2), DSM ACC 2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK-3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2571 (W4A5), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9-3C2);

b) identificar y/o aislar aquellas células en la muestra a las que se ha unido un anticuerpo, o fragmentos del mismo, de la etapa a).

7. Un método para aislar y/o identificar, de tejido primario, células madre mesenqulmales homogéneas, que incluye las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra de células en suspensión obtenida de tejido primario y que incluye células madre mesenqulmales, con un anticuerpo anti-CD271;

b) poner en contacto la muestra de la etapa a) con un anticuerpo, o con fragmentos funcionales del mismo, en el que el anticuerpo se dirige contra CD340 (HER2), contra CD140b, contra CD56, o es uno de los anticuerpos W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1 o F9-3C2, que se producen por las líneas celulares de hibridoma que están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC 2567 (W8B2), DSM ACC 2816 (W1C3), DSMACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK-3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2571 (W4A5), DSM ACC 2819 (58B1), DSMACC 2818 (F9-3C2);

y

c) identificar y/o aislar aquellas células en la muestra a las que se ha unido el anticuerpo de la etapa a), y un anticuerpo de la etapa b) o fragmentos funcionales del mismo.

8. El método como se reivindica en la reivindicación 7, en el que las etapas a) y b) se realizan de manera simultánea, sucesivamente o en orden inverso.

9. El método como se reivindica en las reivindicaciones 6 o 7, en el que el anticuerpo dirigido contra CD56 es 39D5, que se produce por la línea celular de hibridoma que está depositada, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mirkoorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con el número DSM ACC 2930 (39D5).

10. El método como se reivindica en una de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el tejido primario se selecciona del grupo que incluye médula ósea, placenta, tejido adiposo.

11. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo, o fragmentos funcionales del mismo, producido por una línea celular de hibridoma seleccionada del grupo que comprende W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1, F9-3C2F1, 39D5, cuyas líneas celulares de hibridoma están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mirkoorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC 2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK-3D6), DSM ACC

2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9- 3C2), DSM ACC 2930 (39D5).

12. Un kit que contiene al menos un anticuerpo, o fragmentos funcionales del mismo, producido a partir de una línea celular de hibridoma seleccionada del grupo que comprende W1C3, W7C6, W5C4, FIEK-3D6, W3D5, W5C5, 9A3G2, 58B1, F9-3C2F1, 39D5, cuyas líneas celulares de hibridoma están depositadas, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mirkoorganismen und Zellkulturen (DSMZ) con los números DSM ACC

2816 (W1C3), DSM ACC 2821 (W7C6), DSM ACC 2814 (W5C4), DSM ACC 2817 (HEK-3D6), DSM ACC 2815 (W3D5), DSM ACC 2813 (W5C5), DSM ACC 2820 (9A3G2), DSM ACC 2819 (58B1), DSM ACC 2818 (F9-3C2), DSM ACC 2930 (39D5).

13. El kit como se reivindica en la reivindicación 12, que además incluye un anticuerpo anti-CD271.