Especies de levadura genéticamente modificadas y procesos de fermentación que emplean levaduras genéticamente modificadas.

Una célula de levadura que tiene un gen de xilosa isomerasa exógeno que es al menos 80% homólogo con la SEC ID Nº 151 pero no más de 95% homólogo con la SEC ID Nº 58 o que produce una enzima que es al menos 80% homóloga con la SEC ID Nº 152,

pero no más de 95% homóloga con la SEC ID Nº 59.

Especies de levadura genéticamente modificadas y procesos de fermentación que emplean levaduras genéticamente modificadas

Esta invención se realizó bajo en n° de contrato DE-FC07-021D14349 con el Departamento de Energía de EEUU. El gobierno de EEUU tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Esta solicitud reinvindica el beneficio de la solicitud provisional de EEUU n° 60/467.727, presentada el 2 de mayo de 2003.

Esta invención se refiere a ciertas especies de levadura géneticamente modificadas.

Debido al agotamiento gradual de la materia prima del petróleo y del gas natural a nivel mundial, al deseo de parte de las naciones importadoras de petróleo de disminuir su dependencia de fuentes extranjeras de petróleo, y al deseo de establecer una base más sostenible para la economía, se están dedicando grandes esfuerzos a la producción de combustibles y de plásticos y productos químicos orgánicos procedentes de materias primas alternativas. Los procesos de fermentación ofrecen la posibilidad de producir una diversidad de combustibles y productos químicos a partir de fuentes de azúcares naturales. Por ejemplo, se produce etanol en cantidad significativa mediante la fermentación de la glucosa, de forma más tipica de la glucosa obtenida hidrolizando el almidón de maíz. Una especie de levadura, Saccharomyces cerevisiae, es un biocatalizador habitual para fermentar la glucosa en etanol.

Estos azúcares representan una fuente de carbono relativamente cara. La biomasa, es decir, el hldrollzado de materia vegetal, ofrece la posibilidad de ser una fuente de carbono particularmente barata. La biomasa consiste principalmente en celulosa y hemicelulosa. La celulosa puede degradarse en azúcares de hexosa, generalmente glucosa. La mayoría de las levaduras, incluyendo S. cerevisiae, metabollzan los azúcares de hexosa con bastante eficacia. Por otra parte, la hemicelulosa es rica en azúcares de pentosa, tales como xilosa, de forma que una utilización eficaz del carbono requiere que estos azúcares de pentosa se metabolicen bien. Muy pocas levaduras metabolizan de forma eficaz la xilosa en etanol u otros productos de la fermentación deseables. Así, para aprovechar el potencial económico completo que ofrece la utilización de fuentes de carbono de biomasa es necesario proporcionar un biocatalizador que pueda convertir de modo eficaz la xilosa en productos de la fermentación deseables.

Diversas bacterias son capaces de metabolizar la xilosa en productos de la fermentación, pero en general producen una mezcla de productos en lugar de un único producto predominante, tal como se desea habitualmente. Los subproductos habituales a veces son tóxicos para las bacterias. Aunque ciertas bacterias se han modificado metabólicamente para que realicen fermentaciones homoetanólicas, las bacterias tienden a tener una mala actuación en el duro entorno de los hidrolizados lignocelulósicos, que son una fuente habitual de sustratos ricos en xilosa.

Se sabe que algunas especies de levadura, tales como S. cerevisiae, fermentan los azúcares de hexosa predominantemente en etanol en lugar de producir las mezclas de productos que generalmente producen las bacterias. Algunas levaduras tienen otras características que hacen que sean buenas candidatas para diversos tipos de procesos de fermentación, tales como resistencia a entornos de pH bajo, resistencia a ciertos coproductos de la fermentación, tales como ácido acético y furfural, y resistencia al propio etanol.

La mayoría de las especies de levadura metabolizan la xilosa (si es que pueden metabolizarla) a través de una vía compleja, en la que la xilosa en primer lugar se reduce a xilitol a través de una enzima xilosa reductasa (XR). El xilitol entonces se oxida a xilulosa a través de una enzima xilitol deshidrogenasa (XDH). La xilulosa entonces se fosforila a través de una enzima XK. Esta vía funciona de manera ineficaz en especies de levadura porque introduce un desequilibrio redox en la célula. La etapa de xilosa a xilitol emplea NADH como cofactor, mientras que la etapa de xilitol a xilulosa emplea NADPH como cofactor. Deben producirse otros procesos para restablecer el desequilibrio redox dentro de la célula. Esto a menudo significa que el organismo no puede crecer de modo anaerobio sobre la xilosa ni sobre otro azúcar de pentosa.

No obstante, se ha intentado introducir genes de XR y XDH exógenos en especies de levadura, tales como S. cerevisiae, para lograr la conversión de la xilosa en etanol. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU n° 5.866.382, y los documentos WO 95/13362 y WO 97/42307. La levadura modificada no produce etanol de manera eficaz.

Otros organismos pueden isomerizar la xilosa en xilulosa y después fosforilar la xilulosa en xilulosa 5-fosfato, que entonces se metaboliza aún más a través de la vía del carbono central de la célula. La isomerización es estimulada por una enzima catalítica, la xilosa isomerasa (XI), y la fosforilación es catalizada por una enzima xiluloquinasa (XK). Esta vía es habitual en bacterias pero relativamente rara en especies eucariotas, tales como levaduras. No crea el desequilibrio redox de la vía de xilosa a xilitol a xilulosa, y por tanto en principio es un mecanismo anaerobio más eficaz. Se sabe que un hongo anaerobio, Piromyces sp. E2 (ATCC 76762), posee un gen que expresa una enzima XI activa.

Sin embargo, ninguna especie de levadura de tipo salvaje o recombinante tiene la capacidad de producir de modo eficaz productos de la fermentación deseables a partir de la xllosa u otras materias primas de azúcares de pentosa. Un intento de introducir el gen XI de Piromyces sp. E2 en S. cerevisiae produjo un crecimiento muy lento sobre xilosa y no dio como resultado la producción de etanol divulgada. Véase Kuyper et al., "High-Level Functlonal Expression of a Fungal Xylose Isomerase: The Key to Efflclent Ethanolic Fermentaron of Xylose by Saccharomyces Cerevisiae?", FEMS Yeast Research, 1574 (2003), 1-10, y el documento WO 03/062430A1.

Por tanto, resulta muy deseable una especie de levadura que puede fermentar de modo eficaz la xllosa y otros azúcares de pentosa en un producto de la fermentación deseado.

En un aspecto, la invención se refiere a una célula de levadura que tiene un gen de xilosa ¡somerasa exógeno, que es al menos 80% homólogo con la SEC ID N° 151 pero no más de 95% homólogo con la SEC ID N° 58 o que produce una enzima que es al menos 80% homologa con la SEC ID N° 152, pero no más de 95% homologa con la

SEC ID N° 59.

En un aspecto adicional, esta invención es un proceso de fermentación en el que una célula de la invención se cultiva bajo condiciones de fermentación en un caldo de cultivo de fermentación que incluye un azúcar de pentosa.

La figura 1 es un diagrama que muestra el plásmido pNC2.

La figura 2 es un diagrama que muestra el plásmido pNC4.

La figura 3 es un diagrama que muestra el plásmido pVR22.

La figura 4 es un diagrama que muestra el plásmido pVR29.

La figura 5 es un diagrama que muestra los plásmidos pBH5a y pBH5b.

La figura 6 es un diagrama que muestra el ensamblaje del plásmido pVR78 a partir de los plásmidos pVR73 y pVR77.

La figura 7 es un diagrama que muestra el plásmido pCM3.

La figura 8 es un diagrama que muestra el plásmido pPS1.

La figura 9 es un diagrama que muestra el plásmido pCM9.

La figura 10 es un diagrama que muestra el plásmido pCM17.

La figura 11 es un diagrama que muestra el plásmido pCM14.

La figura 12 es un diagrama que muestra el plásmido pCM28.

La figura 13 es un diagrama que muestra el plásmido pVR95.

La figuras 14a y 14b son diagramas que muestran los plásmidos pCM18 y pCM19.

La figura 15 es un diagrama que muestra los plásmidos pBSKura3Km y pBSDeltaUra3KM.

La figura 16 es un diagrama que muestra los plásmidos pVR52, pVR67 y pVR96.

La figura 17 es un diagrama que muestra el plásmido pVR102.

La figura 18 es un diagrama que muestra el plásmido pVR103.

La figura 19 es un diagrama que muestra los plásmidos pVR65 y pVR104.

La figura 20 es un diagrama que muestra el plásmido pCM21 y pCM23.

La figura 21 es un diagrama que muestra el plásmido pCM29.

La figura 22 es un diagrama que muestra el plásmido pVR113.

La figura 23 es un diagrama que muestra el plásmido pCM31.

La figura 24 es un diagrama que muestra el plásmido pVR118.

La figura 25 es un diagrama que muestra el plásmido pCM52.

La figura 26 es un diagrama que muestra el plásmido pCM55.

La figura 27 es un diagrama que muestra el plásmido pCM58.

La figura 28 es un diagrama que muestra el plásmido pMI409.

La figura... [Seguir leyendo]

1. Una célula de levadura que tiene un gen de xilosa isomerasa exógeno que es al menos 80% homólogo con la SEC ID N° 151 pero no más de 95% homólogo con la SEC ID N° 58 o que produce una enzima que es al menos 80% homologa con la SEC ID N° 152, pero no más de 95% homologa con la SEC ID N° 59.

2. La célula de levadura de la reivindicación 1, en la que el gen de xilosa isomerasa está unido operablemente a secuencias promotoras y terminadoras que son funcionales en la célula de levadura y está integrado en el genoma de la célula de levadura.

3. La célula de levadura de la reivindicación 1 ó 2, que además tiene una deleción o alteración de un gen nativo que produce una enzima que cataliza la conversión de xilosa a xilitol.

4. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 3, en la que el gen nativo que produce una enzima que cataliza la conversión de xilosa a xilitol es un gen xilosa reductasa funcional.

5. La célula de levadura genéticamente modificada de cualquier reivindicación anterior, que además tiene una deleción o alteración de un gen xilitol deshidrogenasa nativo funcional.

6. La célula de levadura genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que sobreexpresa una xiluloquinasa funcional.

7. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 6, que contiene un gen xiluloquinasa exógeno funcional unido operablemente a secuencias promotoras y terminadoras que son funcionales en la célula de levadura.

8. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 7, en la que el gen xiluloquinasa exógeno funcional es un gen xiluloquinasa de S. cerevisiae.

9. La célula de levadura genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que es del género Kluyveromyces, Candida, Pichia, Brettanomyces, Pachysolen o Saccharomyces.

10. La célula de levadura genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el gen de xilosa isomerasa codifica una enzima xilosa isomerasa que codifica una enzima que no es más de 95% homologa

con la SEC ID N° 59.

11. Un proceso de fermentación en el que una célula de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 se cultiva bajo condiciones de fermentación en un caldo de cultivo de fermentación que incluye un azúcar de pentosa.

12. El proceso de fermentación de la reivindicación 11, en el que se produce etanol como uno de los productos de fermentación principales.

13. El proceso de fermentación de la reivindicación 11, en el que la célula además tiene integrado en su genoma un gen lactato deshidrogenasa exógeno unido operablemente a secuencias promotoras y terminadoras que son funcionales en la célula de levadura, y se produce lactato como uno de los productos de fermentación principales.

14. El proceso de fermentación de cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que el azúcar de pentosa incluye xilosa.

15. El proceso de fermentación de cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en el que el caldo de cultivo de fermentación incluye además un azúcar de hexosa.