Anticuerpos contra Angiopoyetina 2 humana.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente con angiopoyetina-2 (ANG-2) humana,

caracterizado por que

a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEC ID Nº: 1, una región CDR2 de SEC ID Nº: 2 y una región CDR1 de SEC ID Nº: 3 y

b) el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEC ID Nº: 4, una región CDR2 de SEC ID Nº: 5 y una región CDR1 de SEC ID Nº: 6.

Anticuerpos contra Angiopoyetina 2 humana

La presente invención se refiere a anticuerpos contra la Angiopoyetina 2 humana (anticuerpos anti-ANG-2), a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos, y a usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis está implicada en la patogénesis de una diversidad de trastornos que incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatías proliferativas o degeneración macular relacionada con la edad (AMD), artritis reumatoide y psoriasis (Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 1931-1934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; y Garner, A., Vascular diseases, En: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., y Klintworth, G. K. (eds.), 2a edición, Marcel Dekker, Nueva York (1994), pp 1625-171). En el caso de tumores sólidos, la neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con las células normales. En consecuencia, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones tumorales y supervivencia del paciente en cáncer de mama así como en varios otros tumores (Weidner, N., et al., N. Engl. J. Med. 324 (1991) 1-8; Horak, E.R, et al., Lancet 34 (1992) 112-1124; y Macchiarini, P., et al., Lancet 34 (1992) 145-146).

ANG-2 y anticuerpos anti-ANG-2

La angiopoyetina-2 (ANG-2) humana (como alternativa abreviada con ANGPT2 o ANG2) (SEC ID N°: 17) se describe en Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-6 y Cheung, A.H., et al, Genomics 48 (1998) 389-91. Las angiopoyetinas-1 y 2 (ANG-1 (SEC ID N°: 18) y ANG-2 (SEC ID N°: 17) se descubrieron como ligandos para las Ties, una familia de tirosina quinasas que se expresa selectivamente dentro del endotelio vascular. Yancopoulos, G.D., ef al., Nature 47 (2) 242-48. Hay ahora cuatro miembros definitivos de la familia de la angiopoyetina. La angiopoyetina-3 y 4 (Ang-3 y Ang-4) pueden representar homólogos ampliamente divergentes del mismo locus génico en ratón y ser humano. Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28. ANG-1 y ANG-2 se identificaron originalmente en experimentos de cultivo tisular como agonista y antagonista, respectivamente (véase para ANG-1: Davies, S., et al., Cell, 87 (1996) 1161-1169; y para ANG-2: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-6). Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2, y tanto Ang-1 como 2 se unen con Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd). Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-6. Se ha mostrado que Ang-1 apoya la supervivencia de EC y promueve la integridad del endotelio, Davis, S., ef al., Cell, 87 (1996) 1161-1169; Kwak, H.J., et al., FEBS Lett448 (1999)249-53; Suri, C., et al., Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G., et al., Science 286 (1999)2511-14; Thurston, G., efe/., Nat. Med. 6 (2)46-63, mientras que ANG-2 tuvo el efecto opuesto y promovió la desestabilización de vasos sanguíneos y regresión en ausencia de los factores de supervivencia VEGF o el factor de crecimiento de fibroblastos básico. Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-6. Sin embargo, muchos estudios de la función de ANG-2 han sugerido una situación más compleja. ANG-2 podría ser un regulador complejo de la remodelación vascular que desempeña un papel tanto en el brote de vasos como en la regresión de vasos. Los análisis de expresión revelan que ANG-2 se induce rápidamente, junto con VEGF, en situaciones de brote angiogénico en adultos, mientras que ANG-2 se induce en ausencia de VEGF en situaciones de regresión vascular, lo que apoya dichos papeles para ANG-2. Holash, J., et al., Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J., et al., Oncogene 18 (1999) 5356-62. De forma coherente con un papel dependiente de contexto, ANG-2 se une específicamente con el mismo receptor específico de endotelio, Tie-2, que se activa por Ang-1, pero tiene efectos dependientes del contexto en su activación. Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-6.

Los ensayos de angiogénesis corneana han mostrado que tanto ANG-1 como ANG-2 tenían efectos similares, actuando sinérgicamente con VEGF para promover el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Asahara, T., et al., Circ. Res., 83, (1998) 233-4. La posibilidad de que hubiera una respuesta endotelial dependiente de dosis se planteó por la observación de que in vitro a alta concentración, ANG-2 también puede ser pro-angiogénica. Kim, I., et al., Oncogene 19 (2) 4549-52. A alta concentración, ANG-2 actúa como un factor de supervivencia de apoptosis para células endoteliales durante la apoptosis por privación del suero mediante la activación de Tie2 mediante PI-3 Quinada y la ruta de Akt. Kim, I., et al., Oncogene 19 (2) 4549-52.

Otros experimentos in vitro ha sugerido que durante la exposición prolongada, los efectos de ANG-2 pueden desplazarse progresivamente de los de un antagonista a un agonista de Tie2, y en puntos temporales posteriores, puede contribuir directamente a la formación de tubos vasculares y estabilización de neovasos. Teichert- Kuliszewska, K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (21) 659-7. Además, si se cultivaron EC en gel de fibrina, también se observó activación de Tie2 con ANG-2, lo que quizás sugiere que la acción de ANG-2 podría depender del estado de diferenciación de las EC. Teichert-Kuliszewska; K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (21) 659-7. En EC microvasculares cultivadas en un gel de colágeno tridimensional, ANG-2 también puede inducir la activación de Tie2 y promover la formación de estructuras de tipo capilar. Mochizuki, Y., et al., J. Cell. Sci. 115 (22) 175-83. El uso de

un cocultivo esferoide tridimensional como un modelo in vitro de maduración de vasos demostró que el contacto directo entre EC y células mesenquimales anula la sensibilidad a VEGF, mientras que la presencia de VEGF y ANG- 2 Indujo el brote. Korff, T., et al., Faseb J. 15 (21) 447-57. Etoh, T., et al. demostraron que en las EC que expresaban constitutivamente Tie2, la expresión de MMP-1, 9 y u-PA estaba regulada positivamente por ANG-2 en presencia de VEGF. Etoh, T., et al., Cáncer Res. 61 (21) 2145-53. Con un modelo de membrana pupilar in vivo Lobov, I.B., et al. mostraron que ANG-2 en presencia de VEGF endógeno promueve un aumento rápido del diámetro capilar, remodelación de la lámina basal, proliferación y migración de células endoteliales, y estimula el brote de nuevos vasos sanguíneos. Lobov, I.B., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99 (22) 1125-1. Por el contrario, ANG- 2 promueve la muerte de células endoteliales y regresión vascular sin VEGF endógeno. Lobov, I.B., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99 (22) 1125-1. De forma similar, con un modelo de tumor in vivo, Vajkoczy, P., et al. demostraron que los agregados multicelulares inician el crecimiento vascular por brote angiogénico mediante la expresión simultánea de VEFGR-2 y ANG-2 por endotello del hospedador y tumorales. Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 19 (22) 777-85. Este modelo ¡lustró que la mlcrovasculatura establecida de tumores crecientes se caracteriza por una remodelación continua, mediada potenclalmente por la expresión de VEGF y ANG. Vajkoczy, M.A., et al., J Clin. Invest. 9 (22) 777-85.

Estudios de ratones knock-out de Tie-2 y angiopoyetlna-1 muestran fenotipos similares y sugieren que la fosforilación de Tie-2 estimulada por angiopoyetina 1 media en la remodelación y estabilización de vasos en desarrollo, promoviendo la maduración de vasos sanguíneos durante la angiogénesis y el mantenimiento de la adhesión celular de soporte de células endoteliales. (Dumont, D.J., ef al., Genes & Development, 8 (1994) 1897- 199; Sato, T.N., Nature, 376 (1995) 7-74; Thurston, G., et al., Nature Medicine 6 (2) 46-463). Se cree que el papel de la Angiopoyetina-1 está conservado en el adulto, donde se expresa ampliamente y de forma constitutiva (Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-5; Zagzag, D., et al., Exp Neurology, 159 (1999) 391-4). Por el contrario, la expresión de Angiopoyetina-2 está limitada principalmente a sitios de remodelación vascular donde se cree que bloquea la función de estabilización o maduración constitutiva de la Angiopoyetina-1, permitiendo que los vasos vuelvan a, y permanezcan en, un estado plástico que puede ser más sensible a señales de brote (Hanahan, D., 1997; Holash, J., et al., Orzcogerze 18 (1999) 5356-62; Malsonplerre, P.C., 1997). Los estudios de la expresión de Angiopoyetina-2 en angiogénesis patológica han descubierto que muchos tipos tumorales muestran expresión de Angiopoyetina-2 vascular (Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-6). Los estudios funcionales sugieren que la Angiopoyetina-2 está... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente con angiopoyetina-2 (ANG-2) humana, caracterizado por que

a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEC ID N°: 1, una región CDR2 de SEC ID N°: 2 y una región CDR1 de SEC ID N°: 3 y

b) el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEC ID N°: 4, una reglón CDR2 de SEC ID N°: 5 y una región CDR1 de SEC ID N°: 6.

2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que comprende

a) el dominio variable de cadena pesada de SEC ID N°: 7; y

b) el dominio variable de cadena ligera de SEC ID N°: 8.

3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado por que el anticuerpo no se une con Angiopoyetlna 1 (ANG-1) humana.

4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicho anticuerpo es de la subclase lgG4 humana o es de la subclase lgG1 humana.

5. Una composición farmacéutica caracterizada por que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en terapia.

7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un método para la prevención de la metástasis.

8. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un método de tratamiento del cáncer.

9. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un método de tratamiento de enfermedades vasculares.

1. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un método de tratamiento de la retlnopatía.

11. Un ácido nucleico que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo que se une específicamente con angiopoyetina-2 (ANG-2) humana, caracterizado por que dicho anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera de acuerdo con la reivindicación 1.

12. Un vector de expresión caracterizado por que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 para la expresión de un anticuerpo que se une específicamente con anglopoyetina-2 (ANG-2) humana en una célula hospedadora procarlota o eucarlota.

13. Célula hospedadora procarlota o eucarlota que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 12.