Anticuerpos anti-Notch2 y métodos de uso.

Un anticuerpo monoclonal que se une al dominio de Repetición de Lin12/Notch (LNR)-A y al dominio de heterodimerización (HD)-C de la región reguladora negativa (NRR) de Notch2 e inhibe la actividad de Notch2,

en el que el anticuerpo se une a NRR de Notch2 de ser humano y ratón con una Kd de< 10 nM y en el que el anticuerpo comprende una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado entre las SEC ID Nº: 1-2; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4; una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5; una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº: 6-9; una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº: 11-13; y una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº: 15-18.

Anticuerpos anti-Notch2 y métodos de uso CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere generalmente al campo de la biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos anti-Notch, incluyendo anticuerpos anti-región reguladora negativa de Notch2 (NRR), y a usos de los mismos. También se proporcionan anticuerpos anti-Notch1 NRR y métodos de uso.

ANTECEDENTES

La familia de receptor Notch es una clase de receptores transmembrana conservados evolutivamente que transmiten señales que afectan al desarrollo en organismos tan diversos como erizos de mar y seres humanos. Los receptores Notch y sus ligandos, Delta y Serrate (conocidos como Jagged en mamíferos), son proteínas transmembrana con grandes dominios extracelulares que contienen repeticiones similares a factor de crecimiento epidérmico (EGF). El número de parálogos de Notch difiere entre especies. Por ejemplo, hay cuatro receptores Notch en mamíferos (Notch1-Notch4), dos en Caenorhabditis elegans (LIN-12 y GLP-1) y uno en Drosophila melanogaster (Notch). Los receptores Notch se procesan proteolíticamente durante el transporte a la superficie celular mediante una proteasa similar a furlna en un sitio S1 en el lado N-terminal del dominio transmembrana, produciendo una subunidad extracelular de Notch (ECN) y una subunidad transmembrana de Notch (NTM). Estas dos subunidades permanecen asociadas no covalentemente y constituyen el receptor de la superficie celular heterodimérico maduro. Los receptores Notch y la ruta de señalización de Notch se revisan, por ejemplo, en Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3:587-613, 28, y Bolos et al., Endocrine Reviews 28:339-363, 27.

Las subunidades de ECN de Notch2 contienen 36 repeticiones similares a EGF N-terminales seguidas de tres módulos repetidos en tándem de repeticiones de Lin 12/Notch (LNR) que preceden al sitio S1. Cada módulo LNR contiene tres enlaces disulfuro y un grupo conservado de restos ácidos y polares que se predice que coordinan a un ión de calcio. Dentro de la región de repetición de EGF se encuentran sitios de unión para los ligandos activadores.

El NTM de Notch2 comprende una región extracelular (que porta el sitio de escisión de S2), un segmento transmembrana (que porta el sitio de escisión de S3), y una gran porción intracelular que incluye un dominio de RAM23, seis repeticiones de anquirina, un dominio de transactivación y una secuencia de PEST carboxilo termina. La asociación estable de las subunidades ECN y NTM depende de un dominio de heterodimerización (HD) que comprende el extremo carboxilo terminal del ECN (denominado HD-N) y el extremo extracelular amino terminal de NTM (denominado HD-C). Antes de la activación inducida por ligando, Notch se mantiene en una conformación de reposo mediante una región reguladora negativa (NRR), que comprende los tres LNR y el dominio HD. La estructura cristalina del NRR de Notch2 se comunica en Gordon et al., (27) Nature Structural & Molecular Biology 14:295-3, 27.

La unión de un ligando de Notch a la subunidad ECN inicia dos escisiones proteollticas sucesivas que suceden mediante proteólisis intramembrana regulada. La primera escisión mediante una metaloproteasa (ADAM17) en el sitio S2 hace que la subunidad transmembrana de Notch sea susceptible a una segunda escisión en el sitio S3 próximo a la cara interna de la membrana plasmática. La escisión en el sitio S3, que está catalizada por un complejo multiprotelna que contiene presenilina y nicastrina y que promueve la actividad de y-secretasa, libera la porción intracelular de la subunidad transmembrana de Notch, permitiendo que se trasloque al núcleo y activando la transcripción de genes diana. (Para una revisión de la escisión proteolltica de Notch, véase, por ejemplo, Sisodia et al., Nat. Rev. Neurosci. 3:281-29, 22).

Se han identificado cinco ligandos de Notch de las clases Jagged y similar a Delta en seres humanos (Jaggedl (también denominado Serratel), Jagged2 (también denominado Serrate2), similar a Delta 1 (también denominado DLL1), similar a Delta 3 (también denominado DLL3), y similar a Delta 4 (también denominado DLL4)). Cada uno de los ligandos es una proteína transmembrana de un solo pase con un motivo N-terminal conservado Delta, Serrate, LAG-2 (DSL) esencial para la unión a Notch. Una serie de módulos similares a EGF C-terminal respecto del motivo DSL preceden al segmento transmembrana. A diferencia de los receptores Notch, los ligandos tienen colas citoplasmáticas cortas de 7-215 aminoácidos en el extremo C-terminal. Además, se han comunicado otros tipos de ligandos (por ejemplo, DNER, NB3, y F3/Contactina). (Para una revisión de ligandos de Notch y de la activación de Notch mediada por ligandos, véase, por ejemplo, DSouza et al., Oncogene 27:5148-5167, 28).

La ruta de Notch funciona durante diversos procesos del desarrollo y fisiológicos incluyendo aquellos que afectan a la neurogénesis en moscas y vertebrados. En general, la señalización de Notch está implicada en la inhibición lateral, las decisiones de linaje, y del establecimiento de límites entre grupos de células (véase, por ejemplo, Bray, Molecular Cell Biology 7:678-679,26). Una diversidad de enfermedades humanas, incluyendo cánceres y trastornos neurodegenerativos, han demostrado ser el resultado de mutaciones en genes que codifican a receptores Notch o sus ligandos (véase, por ejemplo, Nam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6:51-59, 22). La conexión entre la señalización de Notch no restringida y neoplasias se reconoció por primera vez cuando una traslocación cromosómica recurrente

t(7:9)(q34:q34.3) que crea una variante truncada constitutivamente activa de Notchl humana se identificó en un subconjunto de leucemias linfoblásticas agudas humanas (T-ALL) (véase, por ejemplo, Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3:587-613, 28). En modelos de ratón, se ha demostrado que la señalización de Notchl es esencial para el desarrollo celular y que las señales mediadas por Notchl promueven el desarrollo de células T en perjuicio del desarrollo de células B (véase, por ejemplo, Wilson et al., J. Exp. Med. 194:13-112, 21).

Notch2 también está implicada en determinados cánceres. En particular, Notch2 se sobreexpresa en leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), que a su vez da lugar a la sobreexpresión de CD23, un marcador distintivo de las células de B-CLL. (Véase Hubmann et al., Blood 99:3742-3747, 22). Tanto Notchl como Notch2 están expresadas de manera elevada en células de mieloma múltiple (células B de plasma cancerosas), y la estimulación con ligando aumenta fuertemente el crecimiento de células tumorales. (Véase Jundt et al., Blood 13:3511-3515, 24). Notch2 y efectores aguas abajo se sobreexpresan en el melanoma (véase Hoek et al., Cáncer Res. 64:527-5282, 24; Seykora et al., Am J Dermatopathol 25:6-11, 23), y el locus de Notch2 se amplifica recurrentemente en líneas celulares de melanoma (Jonsson et al., Oncogene, 26:4738-4748, 27). Además, numerosos estudios han relacionado la señalización aberrante de Notch2 con el cáncer de mama y otros tumores sólidos (revisado por Leong y Karsay, Blood 17:2223-2233, 26). Notch2 también es necesario para el desarrollo de células B de zonas marginales. (Véase Pillai etal., Annu. Rev. Immunol. 23:161-196,25).

Dada la implicación de la señalización de Notch en una gran variedad de enfermedades humanas, está claro que sigue habiendo necesidad de agentes que regulen la señalización de Notch y que tengan atributos clínicos que sean favorables para su desarrollo como agentes terapéuticos. La invención descrita en el presente documento satisface esta necesidad y proporciona otros beneficios.

SUMARIO

La invención proporciona anticuerpos anti-Notch y métodos para usar los mismos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une a NRR de Notch2. En una realización, el anticuerpo inhibe la actividad de Notch2. En otra realización, el anticuerpo no se une significativamente a un miembro

de la familia Notch distinto de Notch2. En otra realización, el anticuerpo se une a NRR de Notch2 de ratón y a NRR de

Notch2 de ser humano. En otra realización, el anticuerpo se une a un NRR de Notch2 con una Kd de < 1 nM.

En una realización adicional, se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une a NRR de Notch2, en el que el anticuerpo comprende:

(a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos que se ajusta a la secuencia consenso de la

SEC ID N°: 3;

(b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4;

(c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 5;

(d) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal que se une al dominio de Repetición de Lin12/Notch (LNR)-A y al dominio de heterodimerización (HD)-C de la región reguladora negativa (NRR) de Notch2 e inhibe la actividad de Notch2, en el que el anticuerpo se une a NRR de Notch2 de ser humano y ratón con una Kd de < 1 nM y en el que el anticuerpo comprende una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado entre las SEC ID N°: 1-2; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 4; una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 5; una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID N°: 6-9; una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID N°: 11-13; y una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID N°: 15-18.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo no se une significativamente a un miembro de la familia Notch distinto de Notch2.

3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 1, la HVR- L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 6, la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 11, y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 15.

4. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, la HVR- L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 7, la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 11, y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 16.

5. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, la HVR- L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 8, la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 12, y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 17.

6. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, la HVR- L1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 9, la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 13, y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 18.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además al menos una reglón marco conservada seleccionada de una región marco conservada de Aceptor 2 variable pesada (VH) humana y una región marco conservada consenso de subgrupo 1 variable ligera (VL) kappa humana.

8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 9 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID N°: 2-21 y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 9 % de Identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID N°: 22-25.

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 9 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2 y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 9 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 22.

1. El anticuerpo de la reivindicación 9, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 22.

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 9 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 21 y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 9 % de Identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID N°: 23-25.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 21, y el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID N°: 23-25.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 1; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 4; una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 5; una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 6; una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 11; y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 15.

14. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre Fab, Fab-SH, Fv, scFv, o (Fab)2.

15. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el anticuerpo es humano, humanizado, o quimérico.

16. Un método para inhibir la actividad de Notch2 in vitro, comprendiendo el método exponer a una célula que expresa 5 Notch2 a un anticuerpo como en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

17. Un anticuerpo como en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso como medicamento.

18. Un anticuerpo como en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso en el tratamiento de una neoplasia de 1 células B.

19. Un anticuerpo como en cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso en el tratamiento del melanoma.