Aislamiento e identificación de células T.

Un método para aislar una o más células T autólogas y específicas para un antígeno de interés de un paciente,

que comprende:

(a) incubar una muestra que comprende células T obtenidas de dicho paciente con dicho antígeno o un derivado del mismo que conserva la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria;

(b) aislar células T específicas para dicho antígeno identificando células que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados entre el grupo constituido por CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados entre el grupo constituido por IL-2, IFNg, TNFa, IL-5, IL-10 e IL-13.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/024548.

Solicitante: BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: ONE BAYLOR PLAZA HOUSTON, TX 77030 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ZANG,JINGWU Z.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K35/12 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Sustancias procedentes de mamíferos; Composiciones que comprenden tejidos o células indeterminadas; Composiciones que comprenden células madre no embrionarias; Células modificadas genéticamente (células madre no caracterizadas A61K 35/545; vacunas o preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00).
  • A61K35/26 A61K 35/00 […] › Linfa; Glándulas linfáticas; Timo; Bazo; Esplenocitos; Timocitos.
  • A61K39/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • C07K7/08 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 7/00 Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › con 12 a 20 aminoácidos.
  • C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N5/0783 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células T; Células NK; Progenitores de células T o NK.
  • C12Q1/02 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen microorganismos vivos.
  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/50 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/564 G01N 33/00 […] › para complejos inmunológicos preexistentes o enfermedades autoinmunes.

PDF original: ES-2537951_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Aislamiento e identificación de células T Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, tal como esclerosis múltiple (MS). Más particularmente, la presente invención se refiere al aislamiento de células T específicas de antígeno. Además, la presente invención se refiere al uso de células T específicas de antígeno para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, tal como MS.

Antecedentes

Los complejos de reconocimiento intercelular formados por receptores de células T (TCR) en linfocitos T citotóxicos o células T cooperadoras y complejos MHC/péptidos en células presentadoras de antígenos (APC) son un componente de reconocimiento habitual en un conjunto diverso de encuentros célula-célula que activan células T tanto durante el desarrollo del repertorio de células T dentro de un organismo individual (selección positiva; selección negativa; supervivencia periférica) y durante las fases de control (T colaboradora) y efectora (T citotóxica) de una respuesta inmunitaria adaptativa.

En la respuesta inmunitaria adaptativa, los antígenos son reconocidos por moléculas hipervariables, tales como anticuerpos o TCR, que se expresan con estructuras suficientemente diversas para ser capaces de reconocer cualquier antígeno. Los anticuerpos pueden unirse a cualquier parte de la superficie de un antígeno. Los TCR, sin embargo, están restringidos a unión a péptidos cortos unidos a moléculas de clase I o clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre la superficie de las APC. El reconocimiento por TCR de un complejo de péptido/MHC desencadena la activación (expansión clonal) de la célula T.

Los TCR son heterodímeros compuestos por dos cadenas que pueden ser a(5 (alfa-beta) o y8 (gamma-delta). La estructura de los TCR es muy similar a la de las inmunoglobulinas (Ig). Cada cadena tiene dos dominios extracelulares, que son pliegues de inmunoglobulina. El dominio amino-terminal es altamente variable y se denomina el dominio variable (V). El dominio más cercano a la membrana es el dominio constante (C). Estos dos dominios son análogos a los de inmunoglobulinas, y se parecen a fragmentos Fab. El dominio V de cada cadena tiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Proximal a la membrana, cada cadena de TCR tiene una corta secuencia de conexión con un residuo de cisterna que forma un puente disulfuro entre ambas cadenas.

Los genes que codifican los heterodímeros aP y y5 se expresan solamente en el linaje de células T. Los cuatro loci del TCR (a, p, 7y 8) tienen una organización de línea germinal muy similar a la de Ig. Las cadenas ay 7 se producen mediante reordenaciones de segmentos V y J, mientras que las cadenas p y 5 se producen mediante reordenaciones de segmentos V, D y J. Los segmentos génicos para las cadenas de TCR están ubicados en diferentes cromosomas, excepto los 8 segmentos génicos de la cadena que están entre los segmentos génicos V y J de la cadena a. La ubicación de los segmentos génicos de la cadena 5 tiene su importancia: una reordenación productiva de segmento génicos de la cadena a deleciona los genes C de la cadena 5, de modo que, en una célula dada, el heterodímero aP no puede ser coexpresado con el receptor 76.

En ratones, existen aproximadamente 1 segmentos génicos Va y 5 Ja y solamente un segmento Ca. La familia de genes de la cadena 8 tiene aproximadamente 1 segmentos génicos V, 2 D y 2 J. La familia de genes de la cadena p tiene 2-3 segmentos V y dos repeticiones idénticas que contienen 1 Dp, 6 jp y 1 Cp. Finalmente, la familia de genes de la cadena 7 contiene 7 V y 3 repeticiones J-C diferentes. En seres humanos la organización es similar a la de ratones, pero el número de segmentos varía.

Las reorganizaciones de segmentos génicos en cadenas a y P es similar a la de Ig. La cadena a, como la cadena ligera de Ig está codificada por los segmentos génicos V, J y C. La cadena p, como la cadena pesada de Ig, está codificada por los segmentos génicos V, D y J. Las reorganizaciones de los segmentos génicos de la cadena a dan como resultado la unión de VJ y las reorganizaciones de la cadena p dan como resultado la unión VDJ. Después de la transcripción de genes reorganizados, procesamiento y traducción de ARN, las cadenas a y P se expresan enlazadas por un puente disulfuro en la membrana de células T.

Los segmentos génicos de TCR están flanqueados por secuencias de reconocimiento de señales (RSS) que contienen un heptámero y un nonámero con una secuencia intermedia de 12 nucleótidos (una vuelta) o 23 nucleótidos (dos vueltas). Como en las Ig, enzimas codificadas por genes activadores de recombinación (RAG-1 y RAG-2) son responsables de los procesos de recombinación. RAG1/2 reconocen la RSS y unen los segmentos V-J y V-D-J de la misma manera que en reorganizaciones de Ig. En resumen, estas enzimas cortan una hebra de ADN entre el segmento génico y la RSS y catalizan la formación de una horquilla en la secuencia codificante. La secuencia señal es posteriormente escindida.

La unión combinatoria de segmentos V y J en cadenas a y segmentos V, D y J en cadenas p produce un gran número de posibles moléculas, creando de este modo varios TCR. La diversidad también se consigue en TCR mediante unión alternativa de segmentos génicos. En contraste con Ig, los segmentos génicos de p y 5 pueden unirse de maneras alternativas. La RSS que flanquea segmentos génicos en segmentos génicos de p y 5 puede generar VJ y VDJ en la cadena p, y VJ, VDJ y VDDJ en la cadena 8. Como en el caso de Ig, la diversidad es producida también mediante variabilidad en la unión de segmentos génicos.

Bucles hipervariables del TCR conocidos como regiones determinantes de la complementariedad (CDR) reconocen la superficie compuesta constituida por una molécula de MHC y un péptido unido. Los bucles CDR2 de a y P contactan solamente con la molécula de MHC en la superficie de APC, mientras que los bucles CDR1 y CDR3 contactan tanto con el péptido como con la molécula de MHC. En comparación con Ig, los TCR tienen una diversidad más limitada en CDR1 y CDR2. Sin embargo, la diversidad de los bucles CDR3 en los TCR es más elevada que la de Ig, dado que los TCR pueden unirse a más de un segmento D dando lugar a un mayor número de uniones.

Se cree que la patogenia de una serie de enfermedades autoinmunitarias está causada por respuestas autoinmunitarias de células T a auto-antígenos presenten en el organismo. No todas las células T autorreactivas son eliminadas en el timo, en contradicción con el paradigma de selección clonal. Aquellas células T con TCR para un amplio espectro de auto-antígenos representan parte del repertorio normal de células T y circulan de forma natural en la periferia. No está claro por qué se permite a las células T autorreactivas, durante su evolución, experimentar diferenciación en el timo y están alojadas en la periferia. Aunque su papel fisiológico no se entiende, estas células T autorreactivas, cuando están activadas, presentan un riesgo potencial en la inducción de patologías autoinmunitarias. También pueden aislarse células T autorreactivas de individuos normales sin las consecuencias de enfermedades autoinmunitarias. Se ha establecido que el reconocimiento antigénico de autorreactividad por sí mismo no es suficiente para mediar en el proceso autodestructivo. Uno de los prerrequisitos para que las células T autorreactivas sean patógenas es que deben estar activadas.

Las células T autorreactivas están implicadas en la patogenia de enfermedades autoinmunitarias, tales como esclerosis múltiple (MS) y artritis reumatoide (RA). Generalmente se considera que la patogenia de células T autorreactivas en MS surge a partir de respuestas de células T a antígenos de mielina, en particular proteína básica de mielina (MBP). Se ha descubierto que las células T reactivas a MBP experimentan activación in vivo, y se produce a una frecuencia de precursores más elevada en sangre y líquido cefalorraquídeo en pacientes con MS en oposición a individuos de control. Estas células T reactivas a MBP producen citoquinas Th1, por ejemplo IL-2, TNFa, e interferón y (IFNy), que facilitan la migración de células inflamatorias al sistema nervioso central y exacerbar respuestas inflamatorias destructoras de mielina en MS.

Las células T reactivas a mielina también han mostrado estar implicados en la patogenia de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en animales, que se parece a MS. La EAE puede ser inducida de forma activa en animales susceptibles inyectando proteínas de mielina emulsionadas en un adyuvante o de forma pasiva inyectando líneas de células T reactivas a mielina y clones derivados... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para aislar una o más células T autólogas y específicas para un antígeno de interés de un paciente, que comprende:

(a) incubar una muestra que comprende células T obtenidas de dicho paciente con dicho antígeno o un derivado del mismo que conserva la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria;

(b) aislar células T específicas para dicho antígeno identificando células que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados entre el grupo constituido por CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados entre el grupo constituido por IL-2, IFNy, TNFa, IL-5, IL-1 e IL-13.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho antígeno es un auto-antígeno, y en el que dicho auto-antígeno se selecciona entre el grupo constituido por proteína básica de mielina, proteína proteolipídica, glucoproteína de oligodendrocito de mielina, péptidos de colágeno de tipo II, proteína de choque térmico, proteína MAGE, PSA, CA125, GAD, y antígeno asociado a un tumor.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho antígeno es un epítopo inmunodominante de un auto-antígeno.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicho epítopo inmunodominante se selecciona entre el grupo constituido por las SEC ID N2: 1-6.

5. El método de la reivindicación 1, en el que las células que expresan dichos primer y segundo marcadores se aíslan usando anticuerpos para dichos primer y segundo marcadores respectivamente, u opcionalmente un anticuerpo biespecífico que se une tanto al primer como al segundo marcadores en combinación con un anticuerpo que se une a dicho segundo marcador.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho primer anticuerpo está marcado de forma fluorescente y dicha célula T se aísla mediante separación de células activadas fluorescentes.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho primer anticuerpo está conjugado con una microperla magnética, y en el que dicha célula T se aísla mediante separación de células activadas magnéticas.

8. El método de la reivindicación 1, en el que dicho antígeno se incuba con dicha muestra durante un intervalo seleccionado entre el grupo constituido por de 1 a 7 días, menos de 1 día, menos de 16 horas, menos de 12 horas, menos de 8 horas, menos de 4 horas y menos de 2 horas.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho primer marcador es CD69.

1. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho segundo marcador es IFNy.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -1, en el que dicho segundo marcador es TNFa.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además etapas de cultivo que permiten la expansión de la población de células T específicas de antígeno aisladas.


 

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