Sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus para uso en el tratamiento de la osteoartritis.

Un sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus,

que comprende un vector adenoviral dependiente de un virus auxiliar que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero, las secuencias repetidas terminales invertidas a izquierda y derecha (L ITR y R ITR), una señal de empaquetamiento adenoviral y las secuencias de ácidos nucleicos de relleno no codificantes y no virales, en donde la expresión del gen del antagonista del receptor de la interleuquina- 1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero es regulada por un promotor inducible por inflamación, que está situado en dirección 5' del marco de lectura de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero, y que es activado específicamente por niveles crecientes de sustancias inmunoestimuladoras.

Sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus para uso en el tratamiento de la osteoartritis

La invención se refiere al campo de la ingeniería genética y proporciona un sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus para uso en el tratamiento de la artrosis en articulaciones humanas o de mamíferos por la expresión génica a largo plazo del antagonista del receptor de interleuquina-1 humano o de mamífero (IL-1 Ra) en células sinoviales.

La artrosis (abreviadamente a veces en lo sucesivo OA, por el correspondiente término en inglés osteoarthritis) es una enfermedad degenerativa de las articulaciones que se produce en las articulaciones humanas o de mamíferos y constituye un grave problema económico y médico (Matthews, G. L., and Hunter, D. J. (2011). Emerging drugs for osteoarthritis. Expert Opin. Emerging Drugs 1-13., Brooks PM. Impact of osteoarthritis on individuáis and society: how much disability? Social consequences and health economic implications. Curr. Opin. Rheumatol. 2002; 14: 573- 577). El cartílago es el tejido conjuntivo resistente que cubre los extremos de los huesos en las articulaciones. Proporciona una superficie relativamente sin fricción y altamente lubricada entre los huesos rígidos y permite un movimiento suave. Durante el desarrollo de la OA, el cartílago se pierde parcial o completamente debido a un desgaste anómalo o excesivo, lo que hace que los extremos óseos expuestos se rocen entre sí dando como resultado inflamación, dolor, hinchazón o pérdida de movilidad. Hasta ahora, no se conocen las razones detalladas de la pérdida del cartílago inicial que conduce a la OA, pero hay una fuerte correlación entre la incidencia y la edad, obesidad y sobreutilización de las articulaciones, tal como una actividad deportiva excesiva. Por consiguiente, la OA es un problema importante, no sólo en los seres humanos, sino en muchos mamíferos, en particular en los caballos que participan en carreras y saltos.

Especialmente en caballos, la OA constituye un problema significativo con un tremendo impacto económico. Los caballos pasan casi toda su vida de pie sobre sus patas y los utilizados con fines deportivos sufren adicionalmente un entrenamiento excesivo. En consecuencia, la mayoría de las articulaciones de los caballos deportivos son fuertemente sobre-utilizadas, lo que con frecuencia les produce cojera. La cojera representa alrededor del 70% de los casos en los que los caballos no pueden participar en carreras o saltos. Alrededor del 60% de los casos puede estar directamente relacionado con la OA (Carón JP, Genovese, RL. Principáis and practices ofjoint disease treatment. En: Ross MW and Dyson S, eds. Diagnosis and Management of Lameness in the Horse. 1 st ed. Philadelphia: Saun- ders, 2003: 746-764). Por lo tanto, la OA es la razón más común de la incapacidad de un caballo para participaren las competiciones de carreras o saltos.

Actualmente no está disponible ningún tratamiento curativo para la OA - ni para caballos, seres humanos ni otra cualquier especie de mamífero. El tratamiento médico está dirigido principalmente a aliviar los síntomas, utilizando fármacos analgésicos, en lugar de restablecer el cartílago desgastado. Un tratamiento analgésico implica por lo general esteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAID), que han demostrado durante décadas eficacia en el tratamiento de la OA. Sin embargo, mientras que estos fármacos pueden suprimir la inflamación de las articulaciones, se sabe que muchos de ellos tienen efectos degenerativos sobre el cartílago, lo que empeora aún más el proceso subyacente del desarrollo de la OA. También se ha utilizado ampliamente, por ejemplo, ácido hialu- rónico que restaura la viscoelasticidad y la lubricación de las articulaciones. Además, han demostrado cierta eficacia los glicosaminoglicanos polisulfatados inyectados en la articulación o por vía intramuscular así como la glucosamina y el sulfato de condroitina administrados por vía oral, sin embargo, sus mecanismos de acción no están completamente comprendidos. Por lo tanto, las terapias utilizadas actualmente tienen solo una eficacia limitada en el tratamiento de la OA y su éxito depende con frecuencia de la gravedad del caso. Además, estos fármacos deben ser administrados con frecuencia, a veces incluso en combinación con otros. Sin embargo, las inyecciones frecuentes de fármacos en la articulación son laboriosas, conllevan riesgo de infecciones, provocan estrés al caballo y son costosas. Además, la cirugía ha mostrado generalmente una baja eficacia en los caballos y sólo se realiza típicamente en sujetos en estado avanzado grave. De ello se desprende que existe una clara y aún no satisfecha necesidad médica de tratamientos más eficaces y prolongados que sean al mismo tiempo también rentables a largo plazo.

En la OA, la interleuquina-1 (IL-1) actúa como mediador central de la inflamación (Dinarello CA. lnterieukin-1 family. En: Thomson AW, Lotz MT (eds). The Cytokine Handbook. Academic Press; London, 2003, pp 643-668). Por otra parte, la IL-1 inhibe fuertemente la síntesis de la matriz por el cartílago y, a altas concentraciones, provoca la rotura de la matriz (Evans, C.H., Gouze, J.N., Gouze, E., Robbins, P.D., and Ghivizzani, S.C. (2004). Osteoarthritis gene therapy. Gene Ther. 11, 379-389). Para neutralizar el efecto de la IL-1 sobre la inflamación sinovial, el tratamiento con antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) constituye un concepto prometedor para el tratamiento de las articulaciones afectadas por artrosis (Evans, C.H., Gouze, J.N., Gouze, E., Robbins, P.D. and Ghivizzani, S.C. (2004). Osteoarthritis gene therapy. Gene Ther. 11, 379-389.; Carón J.P. etal., Chondroprotective effect of intraartic- ular injections of interieukin-1 receptor antagonist in experimental osteoarthritis. Suppression of collagenase-1 ex- pression. Arthritis Rheum. 1996; 39: 1535-44). A nivel de ácidos nucleicos, el IL-1 Ra se conserva considerablemente entre las especies de mamíferos. Por ejemplo, las secuencias de cDNA del IL-1 Ra humano (N° de acceso: NM_173842) comparte una homología del 82% con la variante de múridos (N° de acceso: NM_031167), 84% con la variante equina (N° de acceso: NM_001082525), 84% con la variante canina (N° de acceso: NM_001003096), 84% con la variante de conejo (N° de acceso: NM_001082770) y 82% con la variante bovina (N° de acceso: NM_174357).

El concepto básico de la utilización de terapia génica para el tratamiento de la artritis está bien establecido (Evans

CH, Robbins PD. Gene therapy for arthritis. En: Wolff JA. (ed.). Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transform. Birkhauser Boston, 1994, pp 320-343). En la técnica anterior más afín, se ha descrito el tratamiento de la artrosis equina por administración in vivo del gen del antagonista del receptor de la ¡nterleuqulna-1 equino usando una transferencia génica mediada por adenovirus (D.D. Frisbie, S. C. Ghivizzani, P.D. Robbins, C.H. Evans, C. W. Mcllwraith, Gene Ther. 9, 12-20 (2002)). El vector adenoviral utilizado para la expresión del DNAdel IL-

I Ra equino era un vector adenoviral de primera generación, que se demostró que producía IL-1 Ra equino biológicamente activo. Aunque los exámenes clínicos de los caballos en este estudio Indicaron que la expresión terapéutica del IL-1 Ra disminuyó significativamente los signos de dolor de las articulaciones medidos por el grado de cojera, el efecto de la administración y expresión del transgén del IL-1 Ra equino biológicamente activo fue sólo a corto plazo. Ya a los 30 días del tratamiento de los caballos con IL-1 Ra equino por inyección ¡ntra-artlcular de diversas cantidades del vector que lleva IL-1 Ra, la expresión del IL-1 Ra equino en las articulaciones descendió hasta niveles normales. Se detectaron también resultados similares en la solicitud de patente de EE.UU. 2003/0091536 A1, que describe partículas de adenovirus que codifican un antagonista del receptor de la ¡nterleuqulna-1 para uso en el tratamiento de enfermedades de las articulaciones. Las partículas de adenovirus utilizadas fueron vectores adenovlrales de primera generación.

Los adenovirus dependientes de un virus auxiliar (HDAd), también conocidos como los adenovirus cobardes o de gran capacidad, son la última generación de vectores adenovirales (Mitani, K., Graham, F.L., Caskey, C.T. & Kocha- nek, S. Rescue, propagation and partial purification of a helper virus-dependent adenovirus vector. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92, 3854-3858 (1995); Parks, R.J. et al. A Helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excisión of the viral packaging signa!. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 13565-13570 (1996); Parks,... [Seguir leyendo]

1. Un sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus, que comprende un vector adeno- viral dependiente de un virus auxiliar que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero, las secuencias repetidas terminales invertidas a izquierda y derecha (L ITR y R ITR), una señal de empaquetamiento adenoviral y las secuencias de ácidos nucleicos de relleno no codificantes y no virales, en donde la expresión del gen del antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero es regulada por un promotor inducible por inflamación, que está situado en dirección 5 del marco de lectura de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero, y que es activado específicamente por niveles crecientes de sustancias inmunoestimuladoras.

2. El sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el promotor inducible por inflamación se selecciona del grupo que consiste en promotor NF-kB, promotor de la interleuquina 6 (IL-6), promotor de la interleuquina-1 (IL-1), promotor del factor de necrosis tumoral (TNF), promotor de la ciclooxigenasa 2 (COX-2), promotor del factor 3 del complemento (C3), promotor del material amiloi- de sérico A3 (SAA3), promotor de la proteína inflamatoria de macrófagos-1a (MIP-1a) o construcciones híbridas de los anteriores.

3. El sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus de acuerdo con las reivindicación 1

0 la reivindicación 2, en donde el vector adenoviral dependiente de un virus auxiliar comprende una secuencia de ácidos nucleicos recogida en las páginas 9-23 (SEQ ID NO: 2), o 24-38 (SEQ ID NO: 3) de la parte descriptiva, o una de sus partes biológicamente eficaces.

4. El sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) de mamífero se selecciona del grupo que consiste en IL-1 Ra de múrldo, IL-1 Ra equino, IL-1 Ra canino, IL-1 Ra de gato, IL-1 Ra de conejo, IL-1 Ra de hámster, IL-1 Ra bovino, IL-1 Ra de camello o sus homólogos en otras especies de mamíferos.

5. El sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el vector adenoviral dependiente de un virus auxiliar comprende además un gen marcador que permite la monltorlzaclón del genoma del vector.

6. El sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el vector dependiente de un virus auxiliar comprende una secuencia de ácidos nucleicos recogida en la página 9 (SEQ ID NO: 1) de la parte descriptiva o una de sus secuencias conservadas que codifica los mismos aminoácidos.

7. El sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector dependiente de un virus auxiliar tiene una homología de secuencias de al menos 50%, 60%, 80%, 90% con la secuencia de ácidos nucleicos recogida en la página 9 (SEQ ID NO: 1) de la parte descriptiva.

8. Una composición farmacéutica, que comprende un vector adenoviral dependiente de un virus auxiliar que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero, las secuencias repetidas terminales invertidas a izquierda y derecha (L ITR y R ITR), una señal de empaquetamiento adenoviral y las secuencias de ácidos nucleicos de relleno no codificantes y no virales, en donde la expresión del gen del antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero es regulada por un promotor inducible por inflamación, que está situado en dirección 5 del marco de lectura de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antagonista del receptor de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) humano o de mamífero, y que es activado específicamente por niveles crecientes de las sustancias inmunoestimuladoras.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el promotor inducible por inflamación se selecciona del grupo que consiste en promotor NF-kB, promotor de la interleuquina 6 (IL-6), promotor de la interleuquina-1 (IL-1), promotor del factor de necrosis tumoral (TNF), promotor de la ciclooxigenasa 2 (COX-2), promotor del factor 3 del complemento (C3), promotor del material amiloide sérico A3 (SAA3), promotor de la proteína inflamatoria de macrófagos-1a (MIP-1a) o construcciones híbridas de los anteriores.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el vector adenoviral dependiente de un virus auxiliar comprende una secuencia de ácidos nucleicos recogida en las páginas 9-23 (SEQ ID NO: 2), o 24-38 (SEQ ID NO: 3) de la parte descriptiva o una de sus partes biológicamente eficaces.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antagonista del receptores de la interleuquina-1 (IL-1 Ra) de mamífero se selecciona del grupo que consiste en IL-

1 Ra de múrido, IL-1 Ra equino, IL-1 Ra canino, IL-1 Ra de gato, IL-1 Ra de conejo, IL-1 Ra de hámster, IL-1 Ra bovino, IL-1 Ra de camello o sus homólogos en otras especies de mamíferos.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el vector adenoviral dependiente de un virus auxiliar comprende además un gen marcador que permite la monitori-

zación del genoma del vector.

13. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el vector dependiente de un virus auxiliar comprende una secuencia de ácidos nucleicos recogida en la página 9 (SEQ ID NO: 1) de la parte descriptiva o una de sus secuencias conservadas que codifica los mismos aminoácidos.

14. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde

el vector dependiente de un virus auxiliar tiene una homología de secuencias de al menos 50%, 60%, 80%, 90% con la secuencia de ácidos nucleicos recogida en la página 9 (SEQ ID NO: 1) de la parte descriptiva.

15. El uso de un sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la expresión ex vivo del antagonista del receptor de la interleuquina-1

(IL-1 Ra) en células sinoviales.

16. Un sistema biológico de administración y expresión basado en adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento o la prevención de artrosis o de un estado artrósico en articulaciones humanas o de mamíferos.