Virus oncolíticos que crecen de manera selectiva en células tumorales.

Un polinucleótido que comprende el promotor hTERT, un gen de adenovirus E1A,

una secuencia IRES y un gen de adenovirus E1B en este orden, donde el promotor hTERT consiste en la secuencia SEC ID Nº 4, el gen de adenovirus E1A consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 1, la secuencia IRES consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 3, y el gen de adenovirus E1B consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 2.

Virus oncolíticos que crecen de manera selectiva en células tumorales

Campo de la técnica La presente invención se refiere a un adenovirus que muestra un efecto antitumoral replicando un polinucleótido, que está contenido en el virus, en células tumorales y un agente anticáncer que comprende el virus.

Técnica precedente Hoy día, la terapia genética se lleva a cabo como un procedimiento para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, si en la terapia genética se introduce un gen en un tejido enfermo o similar con un vector vírico incapaz de replicarse, el gen se puede aplicar únicamente a las regiones que están alrededor de las células diana, teniendo en consideración la seguridad del cuerpo humano. También, en la práctica actual de terapia genética, el efecto terapéutico satisfactorio no se puede conseguir debido a la baja eficacia de la trasferencia génica.

Se sabe que la actividad de la telomerasa a menudo está aumentada en las células malignas transformadas o en las cepas de células inmortalizadas mientras que la actividad de la telomerasa es difícil de encontrar en las células somáticas normales, excluyendo las células de la línea germinal, las células de linaje sanguíneo y las células madre epiteliales.

Bajo estas circunstancias, es un objetivo principal de la presente invención permitir que un virus crezca en las células tumorales utilizando la telomerasa activada en estas para de esta manera conseguir la muerte de las células tumorales eficazmente.

El documento CN1339584A desvela un adenovirus, o vector adenovírico, que tiene la capacidad de infectar y replicarse selectivamente en células que tienen actividad telomerasa. El virus o vector comprende la subunidad promotora catalítica de telomerasa humana (hTERT) o el promotor del componente ARN génico de la telomerasa (hTERC) que controlan la expresión de un gen temprano inmediato.

El documento WO 00/46355 desvela los elementos reguladores que promueven la transcripción en células que expresan la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) . Se describen virus oncolíticos, en los que se coloca bajo el control del promotor TERT una toxina o un elemento genético esencial para la replicación vírica. Como resultado, el

virus se replica preferentemente en células que expresan TERT, y destruyen selectivamente las células cancerosas.

El documento WO 01/73093 desvela vectores adenovíricos capaces de replicarse que comprenden un primer y un segundo gen cotranscritos que están bajo el control transcripcional de un elemento regulador de la transcripción heterólogo, específico de una célula diana (TRE) El segundo gen está bajo el control traduccional de un sitio interno de entrada en el ribosoma. Los vectores producen la replicación de virus específicos de células diana en aplicaciones tales como terapia contra el cáncer y terapia genética.

Hiyama y col, Neoplasia 3 (1) , 17-26, 2001 examinaron la expresión de hTERT a nivel celular en materiales clínicos seccionados utilizando inmunohistoquímica, y luego compararon estos resultados con los mismos especímenes en 45 los que también se habían analizado los niveles de actividad de telomerasa.

Holt y Shay, J. Cellular Physiology 180:10-18, 1999, revisan el papel de la telomerasa en la proliferación celular y el cáncer. Zhang y col, Cancer Res. 62 (13) , 3743-3750, 2002 informan de la identificación del promotor humano uroplakin II y su utilización en la construcción de una variante de adenovirus específico del urotelio CG8840 que elimina tumores establecidos en la vejiga en combinación con docetaxel. Kim y col, Cancer Letters 180 (1) , 23-32, 2002 describe los efectos antitumorales de un adenovirus recombinante YKL-1001 que se replica condicionalmente en células cancerosas pequeñas humanas vivas que producen alfa-fetoproteína.

Breve descripción de los dibujos 55 La Fig. 1 muestra un dibujo esquemático de la estructura de un virus oncolítico que se replica selectivamente en células tumorales. Se ha insertado un casete de replicación con consiste en el promotor hTERT, gen E1A, secuencia IRES y gen E1B en la región génica E1 de la que carecen los virus vectores que no tienen la capacidad de replicarse. La Fig. 2 muestra la comparación de las actividades de la telomerasa en células cancerosas humanas y células normales. La Fig. 3 muestra la expresión de los ARNm E1A y E1B y las proteínas después de la infección con TRAD en las células cancerosas humanas y en células normales. La Fig. 4 muestra una replicación intracelular del virus después de la infección con TRAD en células cancerosas 65 humanas y en células normales. La Fig. 5 presenta las fotografías que muestran, tiñendo con Coomasie azul brillante, la citotoxicidad producida por el TRAD en células cancerosas humanas y en células normales. La Fig. 6 presenta fotografías de microscopía que muestran la citotoxicidad producida por TRAD en células cancerosas humanas y en células normales. La Fig. 7 presenta gráficos que muestran por medio del ensayo XTT la citotoxicidad producida por el TRAD en

células cancerosas humanas y en células normales. La Fig. 8 es un gráfico que muestra el efecto antitumoral producido por la administración intratumoral, local de un vector adenovírico, sin capacidad de replicarse, que expresa el gen p53 en un experimento que utiliza ratones desnudos y células H358 humanas de cáncer de pulmón. La Fig. 9 es un gráfico que muestra el efecto antitumoral producido por la administración intratumoral, local de TRAD en un experimento utilizando ratones desnudos y células SW620 humanas de cáncer de intestino grueso.

Divulgación de la invención Los presentes inventores han descubierto por primera vez que, infectando células cancerosas con un virus que tiene 15 un promotor telomerasa y capacidad de replicación, es posible permitir que el virus se replique en las células cancerosas produciendo la muerte de las mismas. Así, se ha conseguido la presente invención.

En consecuencia, la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende un promotor hTERT, un gen de adenovirus E1A, una secuencia IRES y un gen de adenovirus E1B en este orden, en el que el promotor hTERT consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 4, el gen de adenovirus E1A consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 1, la secuencia IRES consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 3, y el gen de adenovirus E1B consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 2.

La invención también proporciona:

- un adenovirus que comprende el polinucleótido de la invención; -una composición farmacéutica que comprende el adenovirus de la invención como principio activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable; -un adenovirus de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal como terapia; -un adenovirus de la invención para su uso en un procedimiento para tratar un cáncer que expresa hTERT; -una composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal como terapia; y -una composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento para tratar un cáncer que 35 expresa hTERT.

Descripción detallada de la invención La presente invención se caracteriza por producir la muerte de las células cancerosas infectando las células cancerosas con un virus que tiene un promotor de telomerasa y capacidad de replicación y permitiendo al virus crecer en las células cancerosas, basándose en el hallazgo de que una amplia variedad de células cancerosas tienen actividad telomerasa.

El virus que se utiliza en la presente invención es un adenovirus. Entre las especies de adenovirus, el adenovirus 45 tipo 5 es particularmente preferido desde el punto de vista, por ejemplo, de su facilidad de uso.

Los virus tienen genes tempranos (E) y genes tardíos (T) implicados en su replicación de ADN. El gen E1 codifica una proteína implicada en la regulación de la transcripción del genoma vírico. Se sabe que el gen E1 está compuesto de E1A, E1B y otros elementos. La proteína E1A codificada por el gen E1A activa la transcripción de un grupo de genes (E1B, E2, E4, etc.) necesarios para la producción de virus infecciosos. La proteína E1B codificada por el gen E1B ayuda a la acumulación del ARNm del gen tardío (gen L) en el citoplasma de la célula huésped infectada y de esta manera inhibe la síntesis proteica de la célula huésped. Por tanto, la proteína E1B promueve la replicación vírica. Las secuencias del gen E1A y del gen E1B del adenovirus se muestran en la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2, respectivamente.

En la presente invención, se utiliza un gen E1 que tiene un gen E1A... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que comprende el promotor hTERT, un gen de adenovirus E1A, una secuencia IRES y un gen de adenovirus E1B en este orden, donde el promotor hTERT consiste en la secuencia SEC ID Nº 4, el gen de adenovirus E1A consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 1, la secuencia IRES consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 3, y el gen de adenovirus E1B consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 2.

2. Un adenovirus que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una composición farmacéutica que comprende el adenovirus de acuerdo con la reivindicación 2 como principio activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Un adenovirus como se definió en la reivindicación 2 para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal como terapia. 15

5. Un adenovirus como se definió en la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa hTERT.

6. Un adenovirus para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde el cáncer que expresa hTERT es al menos

un cáncer seleccionado de entre el grupo que consiste en cáncer de estómago, intestino grueso, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de vejiga, cáncer de vesícula/ conductos biliares, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer de tiroides y cáncer ovárico.

7. El adenovirus para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde el cáncer que expresa hTERT es al menos 25 uno que se selecciona de entre el grupo que consiste en osteosarcoma y tumor cerebral.

8. Una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 3 para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal como terapia.

9. Una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa hTERT.

10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el cáncer que expresa hTERT es al menos un cáncer seleccionado de entre el grupo que consiste en cáncer de estómago, intestino grueso, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de vejiga, cáncer de vesícula/ conductos biliares, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer de tiroides y cáncer ovárico.

11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el cáncer que expresa hTERT es al menos uno que se selecciona de entre el grupo que consiste en osteosarcoma y tumor cerebral. 40