RNA circular monocatenario y método para producirlo.

Un RNA circular monocatenario que tiene un efecto de interferencia de RNA sostenido o de liberación lenta,

caracterizado porque el RNA circular monocatenario comprende una secuencia de cadena con sentido, una secuenciade cadena antisentido complementaria a la secuencia de cadena con sentido, dos secuencias de bucle idénticas odiferentes entre la cadena con sentido y la cadena antisentido, que conectan ambas cadenas, en donde la cadena consentido y la cadena antisentido se emparejan para formar un tallo, y en donde cada una de las dos secuencias de bucletiene de 6 a 9 nucleótidos de longitud.

RNA circular monocatenario y método para producirlo

Campo técnico

La presente invención se refiere a un RNA circular monocatenario, a un método para producir el RNA, y a una composición farmacéutica que comprende el RNA.

Técnica anterior

Los métodos de interferencia de RNA convencionales se clasifican generalmente en dos grupos: un método que utiliza RNAs bicatenarios sintetizados químicamente y un método que utiliza vectores plasmídicos. El método de interferencia de RNA usando vectores plasmídicos se utiliza mucho en el campo de la biotecnología, principalmente en experimentos básicos de biología. Sin embargo, cuando el método de interferencia de RNA se aplica al desarrollo de preparados farmacéuticos, el método que utiliza vectores de plásmido tiene un problema de seguridad para un organismo humano. Por tanto, probablemente es más preferible utilizar los RNAs bicatenario sintetizados químicamente.

Sin embargo, está el problema de que los RNAs bicatenarios sintetizados químicamente son inestables in vivo, es decir, susceptibles de degradarse con enzimas (nucleasas) en las células. Para resolver este problema se han desarrollado cadenas de RNA con ácidos nucleicos no naturales con el fin de mejorar la estabilidad de los RNAs bicatenarios en las células; sin embargo, existe también el problema de que su actividad biológica se reduce mientras que mejora la estabilidad. Además, no se conoce la toxicidad causada por los ácidos nucleicos no naturales. Por tanto, sigue siendo difícil conseguir la aplicación a preparados farmacéuticos.

Las formas de un RNA bicatenario utilizable para el método de interferencia de RNA incluyen un RNA bicatenario que tiene extremos romos o extremos protuberantes, un RNA que tiene una estructura de horquilla con un bucle en cada extremo del RNA bicatenario (documento JP2003 - 502012A) , un ácido nucleico circular que contiene aproximadamente 19 pares de bases, dos bucles, y opcionalmente polinucleótidos modificados químicamente (documento JP2006 271387A) , y similares. Sin embargo, este ácido nucleico circular no se somete a pruebas para ver el efecto de interferencia de RNA.

Además, se describe un ácido nucleico halteriforme quimérico RNA - DNA (JP11 - 137260A (1999) ) . Este ácido nucleico no es para ser usado en la interferencia de RNA. La porción de RNA del ácido nucleico halteriforme se segmenta mediante una enzima en las células, y la porción de DNA antisentido resultante se une a un mRNA en las células para inhibirlo. El documento JP11 -137260A (1999) describe que un ácido nucleico posee una elevada resistencia a las enzimas de degradación de ácido nucleico en las células y se mantiene estable en las células hasta que actúa la ribonucleasa H, debido a su estructura halteriforme. Se describe además que, a causa de que un oligonucleótido de cadena simple que contiene la porción de DNA antisentido puede ser liberado en el citoplasma de las células sólo después de la segmentación de la porción de RNA complementario con el efecto de la ribonucleasa H, se cree que puede mejorarse el efecto antisentido por dosis.

Además, en relación con el método de síntesis de un ácido nucleico circular que tiene una estructura halteriforme, por ejemplo, se describe que se sintetizan oligonucleótidos lineales, se forman una región de tallo y una región de bucle de horquilla para obtener un oligonucleótido halteriforme de muesca, en donde un sitio del oligonucleótido halteriforme circular diana (el extremo opuesto de la región de bucle de horquilla anterior) no está unido, y el extremo 5’ está ligado con una ligasa para preparar un ácido nucleico circular halteriforme (JP11 - 137260 (1999) ) .

Es un objeto de la presente invención proporcionar un RNA circular monocatenario y un método de producción del mismo.

Descripción de la invención Los autores de la presente invención han encontrado ahora que, sorprendentemente, se puede obtener un RNA circular monocatenario con un rendimiento elevado sintetizando por separado una cadena con sentido o codificante y una cadena antisentido, comprendiendo ambas una secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en cada extremo, y permitiendo que actúe la ligasa en los nucleótidos en ambos extremos simultáneamente, y que el RNA circular monocatenario obtenido ejerce un efecto de interferencia de RNA de liberación lenta. Basándose en estos hallazgos científicos, los autores de la presente invención han completado la presente invención.

Más específicamente, la presente invención incluye lo siguiente.

(1) Un RNA circular monocatenario que tiene un efecto de interferencia de RNA sostenido o de liberación lenta, caracterizado porque el RNA circular monocatenario comprende una secuencia de cadena con sentido, una secuencia de cadena antisentido complementaria a la secuencia de la cadena con sentido, dos secuencias de bucle idénticas o distintas entre la cadena con sentido y la cadena antisentido, que conectan cadenas, en donde la cadena con sentido y la cadena antisentido se emparejan para formar un tallo, y en donde cada una de las dos secuencias del bucle tiene de 6 a 9 nucleótidos de longitud.

(2) El RNA circular monocatenario según el apartado anterior (1) , en el que la expresión de un RNA diana es 0, 4 o menos 24 horas después de la introducción del RNA circular monocatenario en células eucariotas, en comparación con las células de control cuyo nivel de expresión del RNA diana se establece en 1.

(3) El RNA circular monocatenario según los anteriores apartados (1) o (2) , en el que el 70 % o más del mismo se conserva después de 8 horas en suero humano.

(4) Un método para producir RNA circular monocatenario de acuerdo con uno cualquiera de los anteriores apartados (1) a (3) , que comprende sintetizar una cadena con sentido y una cadena antisentido, comprendiendo ambos una secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en el extremo 5’ extremo y el extremo 3’, y ligar simultáneamente el nucleótido en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos con nucleótidos no emparejados en la cadena con sentido, con el nucleótido en el extremo 3’ de la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en la cadena antisentido, y viceversa, utilizando una ligasa,

en donde la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en el extremo 5' de la cadena con sentido y la secuencia de nucleótidos con nucleótidos no emparejados en el extremo 3' de la cadena antisentido están unidas entre sí para formar un bucle, la secuencia de nucleótidos con nucleótidos no emparejados en el extremo 3' de la cadena con sentido y la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en el extremo 5' de la cadena antisentido están unidos entre sí para formar un bucle, y la cadena con sentido y la cadena antisentido están emparejados para formar un tallo.

(5) El método de acuerdo con el anterior apartado (4) , que comprende además la fosforilación de cada extremo 5’ de la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en la cadena con sentido y la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en la cadena antisentido.

(6) El método de acuerdo con los anteriores apartados (4) o (5) , en el que las secuencias de bucle son idénticas o distintas entre sí.

(7) El método de acuerdo con una cualquiera de los anteriores apartados (4) a (6) , en el que la longitud del tallo es de 19 a 31 nucleótidos.

(8) Un método de supresión de la expresión de un gen que codifica una proteína in vitro, que comprende introducir el RNA circular monocatenario de acuerdo con uno cualquiera de los anteriores apartados (1) a (3) en células derivadas de seres humanos, y deteriorar un RNA diana mediante el RNA circular monocatenario para inhibir la traducción del RNA diana en la proteína de una manera sostenida.

(9) Un método de supresión de la expresión de un gen que codifica una proteína, que comprende introducir in vitro el RNA circular monocatenario de acuerdo con uno cualquiera de los anteriores apartados (1) a (3) en células de un animal no humano, o de una planta, y deteriorar un RNA diana por el RNA circular monocatenario para inhibir la traducción del RNA diana en la proteína de una manera sostenida.

(10) Una composición farmacéutica que comprende el RNA circular monocatenario según uno cualquiera de los anteriores apartados (1) a (3) como ingrediente activo.

Como se usa en el presente texto, la expresión "RNA circular monocatenario" puede referirse a RNA halteriforme. Un RNA halteriforme se refiere a un RNA circular monocatenario, en el que una cadena con... [Seguir leyendo]

1. Un RNA circular monocatenario que tiene un efecto de interferencia de RNA sostenido o de liberación lenta, caracterizado porque el RNA circular monocatenario comprende una secuencia de cadena con sentido, una secuencia de cadena antisentido complementaria a la secuencia de cadena con sentido, dos secuencias de bucle idénticas o diferentes entre la cadena con sentido y la cadena antisentido, que conectan ambas cadenas, en donde la cadena con sentido y la cadena antisentido se emparejan para formar un tallo, y en donde cada una de las dos secuencias de bucle tiene de 6 a 9 nucleótidos de longitud.

2. El RNA circular monocatenario según la reivindicación 1ª, en el que la expresión de un RNA diana es 0, 4, o menos, 24 horas después de la introducción del RNA circular monocatenario en células eucariotas, en comparación con las células de control cuyo nivel de expresión del RNA diana se establece en 1.

3. El RNA circular monocatenario según la reivindicación 1ª o 2ª, en el que el 70 % o más del mismo se mantiene después de 8 horas en suero humano.

4. Un método para producir el RNA circular monocatenario según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, que comprende sintetizar una cadena con sentido y una cadena antisentido, comprendiendo ambas una secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en el extremo 5’ y en el extremo 3', y simultáneamente ligar el nucleótido en el extremo 5’ de la secuencia de nucleótidos con nucleótidos no emparejados en la cadena con sentido, con el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en la cadena antisentido, y viceversa, usando una ligasa,

en donde la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en el extremo 5’ de la cadena con sentido y la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en el extremo 3’ de la cadena antisentido están unidos entre sí para formar un bucle, la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en el extremo 3’ de la cadena con sentido y la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en el extremo 5’de la cadena antisentido están unidos entre sí para formar un bucle, y la cadena con sentido y la cadena antisentido están emparejadas para formar un tallo.

5. El método según la reivindicación 4ª, que comprende además fosforilar cada extremo 5’ de la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en la cadena con sentido y la secuencia de nucleótidos con los nucleótidos no emparejados en la cadena antisentido.

6. El método según la reivindicación 4ª o 5ª, en el que las secuencias de bucle son idénticas o diferentes entre sí.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4ª a 6ª, en el que la longitud del bucle es de 19 a 31 nucleótidos.

8. Un método para suprimir la expresión de un gen que codifica una proteína in vitro, que comprende introducir el RNA circular monocatenario según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª en células derivadas de seres humanos, y deteriorar un RNA diana por el RNA circular monocatenario para inhibir la traducción del RNA diana en la proteína de una manera sostenida.

9. Un método para suprimir la expresión de un gen que codifica una proteína, que comprende introducir in vitro el RNA circular monocatenario según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª en células de un animal no humano o de una planta, y deteriorar un RNA diana por el RNA circular monocatenario para inhibir la traducción del RNA diana en la proteína de una manera sostenida.

10. Una composición farmacéutica que comprende el RNA circular monocatenario según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª como ingrediente activo.