Células iPS obtenidas a partir de células NKT y células NKT obtenidas a partir de las mismas.

Un método de generación de una célula NKT madura que comprende:

(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena α del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a Vα-Jα uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene:

• la región de la cadena α del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a Vα-Jα uniforme de modo específico de receptor de células NKT, y

• pluripotencia y competencia de replicación, y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;

(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a); y

(c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch.

Células iPS obtenidas a partir de células NKT y células NKT obtenidas a partir de las mismas

Campo técnico

La presente invención se refiere a una célula madre pluripotente inducida obtenida a partir de una célula NKT (a la que se hace referencia de aquí en adelante como célula iPS por sus siglas en inglés) , a células NKT obtenidas a partir de la célula iPS, a un método de producción de la misma y a una aplicación de uso de la misma. La presente invención se refiere también a una célula iPS obtenida a partir de una célula somática en la que se reordena la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T formando V-J uniforme de modo específico del receptor de la célula NKT, a células NKT obtenidas a patir de la célula iPS, a un método de producción de la misma y a una aplicación de uso de la misma.

Antecedentes de la técnica Las células iPS poseen unas capacidades de diferenciación y formación de tejidos equivalentes a las de las células madre embrionarias (células ES por sus siglas en inglés) . Debido a la inducibilidad a partir de células de cultivo primario humanas, las células iPS son células que poseen potencialmente la capacidad de desempeñar un papel clave en la medicina regenerativa. Yamanaka et al. establecieron una célula iPS que posee pluripotencia como las células ES mediante transferencia de cuatro factores (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) a fibroblastos embrionarios de ratón (MEF por la siglas en inglés) (documento no de patente 1) . Además de MEF, tuvieron éxito en establecer células iPS de ratón a partir de otras diversas células (documentos no de patente 2 y 3) , órganos (documento no de patente 4) y similares. Además, también en seres humanos se ha reseñado el establecimiento de células iPS a partir de células somáticas humanas usando la misma técnica (documentos no de patente 5-8) .

Un aspecto que puede ser un impedimento importante para asegurar la eficacia y seguridad de las células iPS en el contexto de su aplicación clínica reside en la diversidad de los mismos. Se especula que el funcionamiento de las células iPS difiere entre diferentes estirpes, dependiendo del fondo genético del individuo, del tipo de células, del grado de reprogramación, de la etapa de génesis en la que se inmortalizan las células y similares. De hecho, incluso en células ES de ratón, el patrón de expresión génica difiere ampliamente dependiendo del fondo genético, y la competencia de diferenciación varía ampliamente entre diferentes estirpes. Se ha encontrado ya por Yamanaka et al. que, también en células iPS humanas, el patrón de expresión génica difiere ampliamente entre diferentes estirpes (documento no de patente 5) . Por lo tanto, se prevé que la competencia de diferenciación y la tendencia a la tumorigénesis varíen considerablemente entre las diferentes células iPS. También hay espacio para una mejora adicional del protocolo de reprogramación nuclear; se han reseñado diversos protocolos mejorados (documentos no de patente 9-14) .

El sistema inmunohematopoyético se ha instaurado desde hace tiempo como sujeto de la medicina regenerativa o citoterapia, desde transfusión de sangre a trasplante de médula ósea y trasplante de sangre de cordón umbilical, y se ha mostrado que estas terapias son sustancialmente eficaces. Se ha mostrado también que, en ratones y seres humanos, puede inducirse la diferenciación a partir de células ES en una variedad de células del sistema inmunohematopoyético. Esto indica que la inducción de células del sistema inmunohematopoyético a partir de células iPS sería potencialmente eficaz como terapia en el marco convencional.

Las células T citolíticas naturales (NKT por sus siglas en inglés) , que son una serie de linfocitos constituyentes del sistema inmunitario, desempeñan un papel clave en la inmunidad antitumoral y las reacciones defensivas ante enfermedades infecciosas por el efecto coadyuvante de la citocina de Th1IFN-; la falta de células NKT conduce a la muerte por infección. Al mismo tiempo, debido a que las respuestas inmunitarias están controladas por IL-10, que es una citocina de Th2 producida por células NKT, los linfocitos son también responsables del control de la reacción inmunitaria ante trasplantes y la supresión del inicio de enfermedades autoinmunitarias. Como se afirma anteriormente, las células NKT ostentan una parte clave del control inmunitario; por lo tanto, la -galactosilceramida (-GalCer) , que es un ligando glicolipídico de células NKT que permite el control artificial de la función celular de los mismos, no es el único regulador de la respuesta inmunitaria disponible actualmente; de hecho, las células NKT están ya en algunas aplicaciones clínicas en pacientes de cáncer de pulmón, y los resultados de estudios clínicos de fase II que se han realizado hasta la fecha muestran que el tiempo medio de supervivencia se alarga tanto como 4-5 veces en comparación con la quimioterapia.

Sin embargo, en pacientes de cáncer sujetos a inmunoterapia con células NKT, se observan reducciones del recuento de células NKT y defectos funcionales (véase, por ejemplo, el documento no de patente 15) , de modo que hay algunos casos en que no puede lograrse una activación de células NKT suficiente para obtener un efecto terapéutico simplemente mediante la administración de células dendríticas con pulsos de -GalCer. En este caso, es posible recoger células NKT del paciente u otra persona del mismo tipo de HLA, propagarlas y devolverlas entonces (trasplantarlas) al paciente; sin embargo, las células NKT están habitualmente presentes en cantidades extremadamente pequeñas de no más de un 0, 1 % de los linfocitos de sangre periférica, y es incómodo propagarlas masivamente. Por lo tanto, a condición de que pueda propagarse un clon de células NKT en grandes cantidades

mediante la reprogramación de las células NKT recogidas, y dejarlas entonces diferenciar y madurar de nuevo, se espera que pueda mejorar el efecto terapéutico de la inmunoterapia de células NKT.

Sin embargo, las células diferenciadas finalmente son menos fáciles de reprogramar, en comparación con las células no diferenciadas; no se han presentado hasta la fecha informes de inducción de células iPS a partir de células T o células NKT. Para las células B, se ha reseñado que las células iPS no pueden inducirse con los denominados cuatro factores o tres factores (Oct3/4, Sox2, Klf4) solos, requiriendo a menudo su inducción el uso de otro gen como factor de reprogramación nuclear (documento no de patente 3) . Sin embargo, se teme que el aumento del número de transgenes agudice los problemas de seguridad, incluyendo la tumorigénesis potencial de las células diferenciadas a partir de células iPS. Además, incluso si las células iPS se establecieran a partir de una célula NKT, seguiría siendo desconocido si podtía inducirse la diferenciación a partir de la célula iPS hasta células NKT maduras funcionales.

[Referencias de la técnica anterior] [Documentos no de patente]

Documento no de patente 1: Cell. 25 de agosto de 2006; 126 (4) : 663-676. Documento no de patente 2: Nature. 19 de julio de 2007; 448 (7151) : 313-317. Epub de 6 de junio de 2007. Documento no de patente 3: Cell. 18 de abril de 2008; 133 (2) : 250-264. Corrección en: Cell. 25 de julio de 2008;

134 (2) : 365. Documento no de patente 4: Science. 1 de agosto de 2008; 321 (5889) : 699-702. Epub e 14 de frebrero de 2008. Documento no de patente 5: Cell. 30 de noviembre de 2007; 131 (5) : 861-872. Documento no de patente 6: Science. 21 de diciembre de 2007; 318 (5858) : 1917-1920. Epub de 20 de noviembre de 2007. Documento no de patente 7: Nature. 10 de enero de 2008; 451 (7175) : 141-146. Epub de 23 de diciembre de 2007. Documento no de patente 8: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 26 de febrero de 2008; 105 (8) ; 2883-2888. Epub de 15 de febrero de 2008. Documento no de patente 9: Nat. Biotechnol. enero de 2008; 26 (1) : 101106. Epub de 30 de noviembre de 2007. Documento no de patente 10: Nat. Biotechnol. agosto de 2008; 26 (8) : 916-924. Epub de 1 de julio de 2008. Documento no de patente 11: Utikal JS, Arnold K, Jaenisch R, Hochedlinger K. "Reprogramming of neural progenitor cells into iPS cells in the absence of exogenous Sox2 expression". Stem Cells. Epub de 17 de julio de 2008. Documento no de patente 12: Nature. 31 de julio de 2008; 454 (7204) : 646-650. Epub de 29 de junio de 2008. Documento no de patente 13: Cell Stem Cell. 5 de junio de 2008; 2 (6) : 525-528. Documento no de patente 14: Curr. BioI. 24 de junio de 2008; 18 (12) : 890-894. Epub de 22 de mayo de 2008. Documento no de patente 15: J. Immunol. 2006 177: 3484-3492

Sumario de la invención Problemas a resolver por la invención Es un objeto... [Seguir leyendo]

1. Un método de generación de una célula NKT madura que comprende:

(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene:

la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, y pluripotencia y competencia de replicación, y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;

(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a) ; y (c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal 15 que no expresa un ligando de Notch.

2. El método según la reivindicación 1, en donde:

la célula somática de la que se ha obtenido la célula iPS es una célula NKT o fibroblasto; y/o los factores de reprogramación nuclear usados para obtener la célula iPS son Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc o ácidos nucleicos que codifican los mismos, o Oct3/4, Sox2 y Klf4 o ácidos nucleicos que 20 codifican los mismos.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la célula somática de la que se ha obtenido la célula iPS es de origen humano.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cocultivo de la etapa (c) se

efectúa en presencia de dos o más citocinas seleccionadas de interleucina 2, interleucina 7, interleucina 15 y ligando 25 de Flt3.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el cocultivo de la etapa (c) se efectúa en presencia de interleucina 15.

6. Un método de generación de una célula NKT activada que comprende:

(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene:

la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J 35 uniforme de modo específico de receptor de células NKT y pluripotencia y competencia de replicación, y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;

(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a) ;

(c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y (d) poner en contacto la célula NKT madura obtenida en la etapa (c) con una célula dendrítica presentadora de -galactosilceramida, en donde la puesta en contacto se lleva a cabo in vitro.

7. Un método para la producción de un agente para uso en un método de citoterapia de células NKT que 45 comprende:

(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto

factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene:

la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J 5 uniforme de modo específico de receptor de células NKT y pluripotencia y competencia de replicación, y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;

(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a) ;

(c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y

(d) poner en contacto la célula NKT madura obtenida en la etapa (c) con una célula dendrítica presentadora de -galactosilceramida, en donde la puesta en contacto se lleva a cabo in vitro; y

(e) combinar la célula NKT activada obtenido en la etapa (d) con un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Un método para la producción de un agente para uso en un método de citoterapia de células NKT en combinación con -galactosilceramida que comprende:

(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene:

la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT y pluripotencia y competencia de replicación, y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;

(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a) ;

(c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y

(d) combinar la célula obtenida en la etapa (d) con un portador farmacéuticamente aceptable; y (e) combinar -galactosilceramida con un portador farmacéuticamente aceptable.