Método para producir L aminoácidos.

Método para producir un aminoácido, que comprende las etapas siguientes:

cultivar una bacteria, que tiene la capacidad para producir el aminoácido, en un medio de cultivo, para producir y acumular el aminoácido en el medio, y recuperar el aminoácido a partir del medio, perteneciendo dicha bacteria al género Escherichia, en la que la resistencia a L-treonina de dicha bacteria está potenciada potenciando la actividad de una proteína como se define en los siguientes apartados (A) o (B) en las células de dicha bacteria: (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 4 en el Listado de Secuencias; o (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 4 en el Listado de Secuencias, y que tiene la actividad de hacer que una bacteria tenga la proteína resistente a L-treonina.

Método para producir L-aminoácidos.

Campo técnico La presente invención se refiere a la biotecnología, y más particularmente a un método para producir un aminoácido, especialmente a un método para producir L-homoserina, L-treonina, L-valina o L-leucina usando una bacteria que pertenece al género Escherichia.

Antecedentes de la técnica Se ha obtenido, con respecto a K-12 de E. coli, un mutante que tiene la mutación thrR que está involucrado en la resistencia a concentraciones elevadas de treonina u homoserina en un medio mínimo (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985) ) . La mutación mejoró la producción de L-treonina (patente SU nº 974817) , de homoserina y de glutamato (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991) mediante las cepas productoras de E. coli respectivas.

Además, se ha revelado que la mutación thrR existe a 18 min en el cromosoma de E. coli, y que la mutación surge en ORF1 entre los genes pexB y ompX. La unidad que expresa una proteína codificada por el ORF se ha designado como gen rhtA (rht: resistencia a homoserina y treonina) . El gen rhtA incluye una región no codificante en 5’ que incluye la secuencia de SD, el ORF1 y un terminador. También, se ha encontrado que un gen rhtA de tipo natural participa en la resistencia a treonina y a homoserina si se clona en un estado de múltiples copias, y que la mutación rhtA23 es una sustitución de A por G en la posición –1 con respecto al codón de partida de ATG (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistr y and Molecular Biology junto con 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistr y and Molecular Biology, San Francisco, California, 24-29 de agosto de 1997, resumen nº 457) .

Se ha encontrado previamente que existen en E. coli, durante la clonación del gen rhtA, al menos dos genes diferentes que proporcionan resistencia a treonina y a homoserina en un estado de múltiples copias. Uno de los genes es el gen rhtA, y se encontró que el otro gen era el gen rthB que confiere resistencia a homoserina (solicitud de patente rusa nº 98118425) .

Descripción de la invención Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para producir un aminoácido, especialmente L-homoserina, L-treonina y aminoácidos de cadena ramificada, con un mayor rendimiento.

Se ha encontrado que una región a 86 min sobre el cromosoma de E. coli, cuando se clona mediante un vector de múltiples copias, imparte resistencia a L-homoserina a células de E. coli. Se ha encontrado además que existe en la región en dirección 5’ otro gen, rhtC, que implica resistencia a treonina, y que cuando se amplifican estos genes la productividad de aminoácidos de E. coli se puede mejorar como el gen rthA. En base a estos hallazgos, se ha completado la presente invención.

De este modo, es divulgado lo expuesto a continuación:

(1) una bacteria que pertenece al género de Escherichia, en la que la resistencia a L-treonina de la bacteria está potenciada potenciando una actividad de proteína como se define en los siguientes apartados (A) o (B) en una célula de la bacteria:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 4; o

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye la supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 4, y que tiene una actividad que hace que la bacteria tenga la proteína resistente a L-treonina;

(2) la bacteria según (1) , en la que la resistencia a L-homoserina de la bacteria está potenciada potenciando una actividad de proteína como se define en los siguientes apartados (C) o (D) en una célula de la bacteria:

(C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 2; o

(D) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye la supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 2, y que tiene una actividad que hace que una bacteria tenga la proteína resistente a L-homoserina;

(3) la bacteria según (1) o (2) , en la que la actividad de proteína como se define en los apartados (A) o (B) está

potenciada mediante la transformación de la bacteria con ADN que codifica la proteína como se define en los apartados (A) o (B) ;

(4) la bacteria según (2) , en la que la actividad de proteína como se define en los apartados (C) o (D) está potenciada mediante la transformación de la bacteria con ADN que codifica la proteína como se define en los apartados (C) o (D) ;

(5) un método para producir un aminoácido, que comprende las etapas siguientes:

cultivar la bacteria como se define en uno cualquiera de los apartados (1) a (4) , que tiene la capacidad de producir un aminoácido, en un medio de cultivo, para producir y acumular el aminoácido en el medio, y recuperar el aminoácido del medio;

(6) el método según (5) , en el que el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en L-homoserina, L-treonina y aminoácidos de cadena ramificada;

(7) el método según (6) , en el que el aminoácido de cadena ramificada es L-valina o L-leucina;

(8) un ADN que codifica una proteína definida en los siguientes apartados (A) o (B) :

(A) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 4;

(B) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 4, que incluye la sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene una actividad para hacer que la bacteria tenga la proteína resistente a L-treonina;

(9) el ADN de (8) que es un ADN definido en los siguientes apartados (a) o (b) :

(a) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº : 3;

(b) un ADN que se puede hibridar con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº : 3, o una sonda preparada a partir de la secuencia nucleotídica en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que tiene la actividad de hacer que una bacteria tenga la proteína resistente a L-treonina; y

(10) el ADN de (9) , en el que la condición restrictiva es una condición en la que el lavado se realiza a 60º C, y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0, 1% de SDS.

El fragmento de ADN que codifica la proteína como se define en los apartados (A) o (B) anteriores se puede denominar como “gen rhtC”; una proteína codificada por el gen rhtC se puede denominar como la “proteína RhtC”; el ADN que codifica la proteína como se define en los apartados (C) o (D) anteriores se puede denominar como “gen rhtB”; una proteína codificada por el gen rhtB se puede denominar como “proteína RhtB”. Una actividad de la proteína RhtC que participa en la resistencia a L-treonina de una bacteria (es decir, una actividad que hace que la bacteria tenga la proteína RhtC resistente a L-treonina) se puede denominar como “actividad Rt”; y una actividad de la proteína RhtB que participa en la resistencia a L-homoserina de una bacteria (es decir, una actividad que hace que una bacteria tenga la proteína RhtB resistente a L-homoserina) se puede denominar como “actividad Rh”. Un gen estructural que codifica la proteína RhtC o la proteína RhtB en el gen rhtC o rhtB se puede denominar como “gen estructural de rhtC” o “gen estructural de rhtB”. La expresión “potenciar la actividad de Rt o la actividad de Rh” significa impartir resistencia a treonina o a homoserina a una bacteria, o potenciar la resistencia por medio del aumento del número de moléculas de la proteína RhtC o de la proteína RhtB aumentando una actividad específica de estas proteínas, o desensibilizando la regulación negativa frente a la expresión o la actividad de estas proteínas o similar. La expresión “ADN que codifica una proteína” significa un ADN que tiene una cadena que codifica la proteína cuando el ADN es bicatenario. La expresión resistencia a L-treonina significa que una bacteria crece en un medio mínimo que contiene L-treonina a una concentración a la que su cepa de tipo natural no crece, habitualmente > 30 mg/ml. La expresión resistencia a L-homoserina significa que una bacteria crece en un medio mínimo que contiene L-homoserina a una concentración a la que su cepa de tipo natural no crece, habitualmente a > 5 mg/ml. La capacidad para producir un aminoácido significa que una bacteria produce y acumula el aminoácido en un medio...

1. Método para producir el aminoácido L-homoserina o L-treonina, que comprende las etapas siguientes:

cultivar una bacteria, que presenta la capacidad para producir el aminoácido, en un medio de cultivo, para producir y acumular el aminoácido en el medio, y

recuperar el aminoácido a partir del medio, perteneciendo dicha bacteria al género Escherichia, en el que la resistencia a L-treonina de dicha bacteria está potenciada potenciando la actividad de una proteína como se define en los apartados (A) o (B) siguientes en las células de dicha bacteria:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº : 4 en el listado de secuencias; o (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº : 4 en el listado de secuencias, y que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-treonina,

en el que la proteína está codificada por un ADN que se define en los apartados (a) o (b) siguientes:

(a) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº : 3;

(b) un ADN que se hibrida con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº :

3 en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-treonina, en el que la condición restrictiva es una condición en la que el lavado se realiza a 60º C y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0, 1% de SDS.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la resistencia a L-homoserina de dicha bacteria está potenciada además potenciando la actividad de una proteína como se define en los apartados (C) o (D) siguientes en las células de dicha bacteria:

(C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº : 2 en el listado de secuencias; o 35

(D) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº : 2 en el listado de secuencias, y que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-homoserina.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la proteína como se define en (C) o (D) está codificada por un ADN que se define en los puntos (c) o (d) siguientes:

(c) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 en SEC ID nº : 1; 45

(d) un ADN que se hibrida con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 en SEC ID nº : 1 en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-homoserina, en el que la condición restrictiva es una condición en la que el lavado se realiza a 60º C y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0, 1% de SDS.

4. Método para producir un aminoácido, que comprende las etapas siguientes:

cultivar una bacteria, que presenta la capacidad para producir el aminoácido, en un medio de cultivo, para 55 producir y acumular el aminoácido en el medio, y

recuperar el aminoácido a partir del medio, perteneciendo dicha bacteria al género Escherichia, en el que la resistencia a L-treonina de dicha bacteria está potenciada potenciando la actividad de una proteína como se define en los apartados (A) o (B) siguientes en las células de dicha bacteria:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº : 4 en el listado de secuencias; o

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción

o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº : 4 en el listado de secuencias, y que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente

a L-treonina,

en el que la proteína está codificada por un ADN que se define en los apartados (a) o (b) siguientes:

(a) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº : 3;

(b) un ADN que se hibrida con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº : 3 en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-treonina, en el que la condición restrictiva es una condición en la que el lavado se realiza a 60º C y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0, 1% de SDS, y

en el que la resistencia a L-homoserina de dicha bacteria está potenciada además potenciando la actividad de una proteína como se define en los apartados (C) o (D) siguientes en las células de dicha bacteria:

(C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº : 2 en el listado de secuencias; o (D) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº : 2 en el

listado de secuencias, y que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-homoserina.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho aminoácido es un aminoácido de cadena ramificada.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicho aminoácido de cadena ramificada es L-valina o L-leucina.

7. Método según la reivindicación 4, en el que la proteína como se define en (C) o (D) está codificada por un ADN que se define en los apartados (c) o (d) siguientes:

(c) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 en SEC ID nº : 1;

(d) un ADN que se hibrida con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 en SEC ID nº : 1 en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-homoserina, en el que la condición restrictiva es una condición en la que el lavado se realiza a 60º C y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0, 1% de SDS.