Factor de crecimiento neurotrófico.

Uso de un factor de crecimiento neurotrófico codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico desde la posición 81 hasta la 419 de la secuencia ilustrada en la figura n.

º 1 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir trastornos neurales.

Factor de crecimiento neurotrófico

La presente invención se refiere a un factor neurotrófico y, en particular, a la clonación y expresión de un miembro novedoso de la familia GDNF de factores neurotróficos, denominado en el presente documento como "enovina" (EVN, "enovin").

Introducción

Los factores neurotróficos están implicados en la diferenciación, desarrollo y mantenimiento neuronal. Estas proteínas pueden prevenir la degeneración y promover la supervivencia de diferentes tipos de células neuronales y por tanto son agentes terapéuticos potenciales para enfermedades neurodegenerativas. El factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) fue el primer miembro de una subfamilia creciente de factores neurotróficos estructuralmente diferenciados de las neurotrofinas. El GDNF es un miembro de la superfamilia de factores de crecimiento del factor p de crecimiento transformante (TGF-P), caracterizada por un patrón específico de siete residuos de cisterna sumamente conservados dentro de la secuencia de aminoácidos (Kingsley, 1994). El GDNF se purificó originalmente usando un ensayo basado en su capacidad para mantener la supervivencia y la función de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral embrionario in vitro (Lin y otros, 1993). Otros tipos de células neuronales en los sistemas nerviosos central (SNC) o periférico (SNP) también responden a los efectos de supervivencia del GDNF (Henderson y otros, 1994, Buj-Bello y otros, 1995, Mount y otros, 1995, Oppenheim y otros, 1995). El GDNF se produce por células en una proforma inactiva, que se escinde específicamente en un sitio de reconocimiento de la RXXR furina para producir GDNF activo (maduro) (Lin y otros, 1993). La administración exógena de GDNF tiene potentes efectos neuroprotectores en modelos animales de la enfermedad de Parkinson, un trastorno neurodegenerativo común caracterizado por la pérdida de hasta el 70% de las células dopaminérgicas en la sustancia negra del cerebro (Beck y otros, 1995, Tomac y otros, 1995, Gash y otros, 1996, Choi-Lundberg y otros, 1997, Bilang-Bleuel y otros, 1997).

Recientemente, se han descubierto factores neurotróficos adicionales de la familia del GDNF. La neurturina (NTN) se purificó a partir de medio condicionado de células ovario de hámster chino (CHO) usando un ensayo basado en su capacidad para promover la supervivencia de neuronas simpáticas en cultivo (Kotzbauer y otros, 1996). La proteína NTN madura es similar en un 57% al GDNF maduro. La persefina (PSP) se descubrió mediante clonación usando PCR de cebador degenerado con ADN genómico como molde. La PSP madura, como el GDNF maduro, promueve la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral y de neuronas motoras en cultivo (Milbrandt y otros, 1998). La similitud de la proteína PSP madura con GDNF maduro y NTN es = 50%. La artemina (ARTN) se descubrió mediante búsqueda en base de datos de ADN y es un factor de supervivencia de neuronas simpáticas y sensoriales en cultivo (Baloh y otros, 1998b).

GDNF, NTN, PSP y ARTN requieren un complejo de receptor heterodimérico con el fin de llevar a cabo la transducción de señales intracelular en sentido 3. El GDNF se une a la subunidad alfa 1 del receptor de la familia de GDNF (GFRa-1; GFRa Nomenclatura Committee, 1997), una proteína de membrana fijada a glicosil-fosfatidil-inositol (glicosil-Ptdlns) (Jing y otros, 1996, Treanor y otros, 1996, Sanicola y otros, 1997). El complejo GDNF/GFRa-1 se une posteriormente a, y activa, el protooncogen cRET, una tirosina cinasa unida a membrana (Durbec y otros, 1996, Trupp y otros, 1996), dando como resultado la fosforilación de residuos de tirosina en cRET y posterior activación de las rutas de transducción de señal en sentido 3 (Worby y otros, 1996). Se han caracterizado varios otros miembros de la familia de GFRa de receptores de unión a ligando (Baloh y otros, 1997, Sanicola y otros, 1997, Klein y otros,

1997, Buj-Bello y otros, 1997, Suvanto y otros, 1997). Se han identificado GFRa-2 y GFRa-3 (Jing y otros, 1997, Masure y otros, 1998, Woby y otros, 1998, Naveilham y otros, 1998, Baloh y otros, 1998a) por varios grupos diferentes. GFRa-1 y GFRa-2 se expresan ampliamente en casi todos los tejidos y la expresión puede regularse mediante el desarrollo (Sanicola y otros, 1997, Widenfalk y otros, 1997).

GFRa-3 no se expresa en el sistema nervioso central en desarrollo o adulto, pero se expresa ampliamente en diversos ganglios simpáticos y sensoriales en desarrollo y adultos del sistema nervioso periférico (Widenfalk y otros,

1998, Naveilhan y otros, 1998, Baloh y otros, 1998a). Un cuarto miembro de la familia, GFRa-4, se clonó a partir de ADNc de pollo (Thompson y otros,1998). GFRa-1 es el receptor preferido para GDNF, mientras que GFRa-2 se une preferiblemente a NTN (Jing y otros, 1996, Treanor y otros, 1996, Klein y otros, 1997). El GFRa-4 de pollo forma un complejo de receptor funcional para PSP en combinación con cRET (Enokido y otros, 1998). Se mostró que las células que expresan tanto GFRa-3 como cRET no respondían a GDNF, NTN ni PSP (Worby y otros, 1998, Baloh y otros, 1998a). Recientemente, se ha mostrado que ART señaliza a través de cRET utilizando GFRa-3 como el receptor de unión a ligando preferido (Baloh y otros, 1998b). La superposición entre los factores neurotróficos y receptores GFRa es posible in vitro, ya que el GDNF puede unirse a GFRa-2 o GFRa-3 en presencia de cRET (Sanicola y otros, 1997, Trupp y otros, 1998) y NTN puede unirse a GFRa-1 con baja afinidad (Klein y otros, 1997). En resumen, GDNF, NTN, PSP y ART son parte de un sistema de señalización neurotrófico mediante el cual diferentes subunidades de unión a ligando (GFRa-1 a -4) pueden interaccionar con la misma subunidad de tirosina cinasa (cRET). La relevancia fisiológica de estos hallazgos in vitro se mostró recientemente en estudios de

deficiencia génica (revisado por Rosenthal, 1999), que muestran claramente que el GDNF interacciona con GFRa-1 in vivo, mientras que NTN es el ligando preferido para GFRa-2.

Los presentes inventores han identificado, clonado, expresado, localizado cromosómicamente y caracterizado enovina (EVN), el cuarto miembro de la familia de GDNF. El conocimiento de la proteína de EVN madura se ha ampliado con el descubrimiento de diferentes variantes de corte y empalme de ARNm funcionales y no funcionales. Además, se presentan datos de expresión, datos de unión de EVN a GFRa-3 y efectos in vitro de EVN sobre el crecimiento en exceso de neurita y la protección frente a la neurotoxicidad inducida portaxol en cultivos celulares de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciado porestaurosporina.

Sumario de la invención

En la presente solicitud, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para un factor de crecimiento neurotrófico humano novedoso, "enovina", un vector de expresión que comprende dicha molécula de ácido nucleico, una célula huésped transformada con dicho vector, factor de crecimiento neurotrófico codificado por dicha molécula de ácido nucleico, enovina aislada, compuestos que actúan como agonistas o antagonistas de enovina y composiciones farmacéuticas que contienen el ácido nucleico o la proteína de enovina o los agonistas o antagonistas de la misma.

Descripción detallada de la invención

Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para un factor de crecimiento neurotrófico humano, denominado en el presente documento como enovina, que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la figura 21, o que codifica para un bioprecursor, derivado o equivalente funcional de dicho factor de crecimiento. Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico es ADN y aún más preferiblemente una molécula de ADNc.

Preferiblemente, el ácido nucleico según la invención comprende la secuencia desde las posiciones 81 hasta 419 de la secuencia ilustrada en figura 1 y más preferiblemente desde las posiciones 81 hasta 422 y aún más preferiblemente la secuencia completa ilustrada en la figura 1.

Se cree que la molécula de ácido nucleico desde la posición 81 hasta 419 codifica para la secuencia de la proteína de enovina madura tras el tratamiento de la proforma de la proteína en el sitio de tratamiento RXXR presente en la proforma estable de dicha proteína de enovina.

Ventajosamente, la molécula de ácido nucleico según la invención puede usarse para expresar el factor de crecimiento neurotrófico humano según la invención, en una célula huésped o similar usando un vector de expresión apropiado.

Un vector de expresión incluye vectores que pueden expresar el ADN unido de manera funcional a secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras,... [Seguir leyendo]

1. Uso de un factor de crecimiento neurotrófico codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico desde la posición 81 hasta la 419 de la secuencia ilustrada en la figura n.2 1 en la fabricación de

un medicamento para tratar o prevenir trastornos neurales.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho trastorno neural se selecciona de cualquiera del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, trastornos neuronales asociados con secuencias de poliglutamina extendidas, tales como la enfermedad de Huntingdon, neuropatía periférica, lesión cerebral aguda,

tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, traumatismo nervioso periférico o lesión por exposición a neurotoxinas, neoplasia endocrina múltiple y enfermedad de Hirschsprung familiar, enfermedades asociadas con prión, enfermedad de Creutzfeld-Jacob y accidente cerebrovascular.

3. Uso de una molécula de ácido nucleico que codifica para un factor de crecimiento neurotrófico humano 15 denominado enovina y que tiene la secuencia de ácido nucleico desde la posición 81 hasta la 419 de la secuencia

ilustrada en la figura n.21 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir trastornos neurales.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicho trastorno neural se selecciona de cualquiera del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, trastornos neuronales asociados con secuencias de

poliglutamina extendidas, tales como la enfermedad de Huntingdon, neuropatía periférica, lesión cerebral aguda, tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, traumatismo nervioso periférico o lesión por exposición a neurotoxinas, neoplasia endocrina múltiple y enfermedad de Hirschsprung familiar, enfermedades asociadas con prión, enfermedad de Creutzfeld-Jacob y accidente cerebrovascular.