Anticuerpos inhibidores de GDF-8 y usos de los mismos.

Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a los aminoácidos 1 a 50 de SEC ID Nº:

15, en el que el anticuerpo reduce la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética.

Anticuerpos inhibidores de GDF-8 y usos de los mismos La presente solicitud reivindica prioridad respecto a la solicitud provisional de Patente de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/324.528, presentada el 26 de septiembre de 2001.

Campo de la invención La presente invención se refiere a inhibidores del Factor de Diferenciación del Crecimiento 8 (GDF-8) proteínas y procedimientos de uso para dichos inhibidores. Más particularmente, la invención proporciona anticuerpos novedosos y fragmentos de anticuerpo que son específicamente reactivos con proteínas GDF-8 in vivo e in vitro. La invención es particularmente útil para diagnosticar, prevenir, o tratar trastornos de seres humanos o animales en los que sería terapéuticamente beneficioso un aumento en el tejido muscular. Los trastornos ejemplares incluyen trastornos neuromusculares (por ejemplo, distrofia muscular y atrofia muscular) , enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de pérdida de masa muscular, sarcopenia, y caquexia; trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad) ; diabetes tipo 2; y enfermedad degenerativa del hueso (por ejemplo, osteoporosis) .

Antecedentes de la invención El Factor de Crecimiento y Diferenciación 8 (GDF-8) , también conocido como miostatina, es un miembro de la superfamilia del Factor de Crecimiento Transformante-beta (TGF-β) de factores de crecimiento relacionados estructuralmente, todos los cuales poseen propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento fisiológicamente importantes (Kingsley y col. (1994) Genes Dev., 8: 133-46; Hoodless y col. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228: 235-72) . GDF-8 es un regulador negativo de la masa muscular esquelética, y hay un interés considerable en identificar factores que regulan su actividad biológica. Por ejemplo, GDF-8 se encuentra altamente expresado en el músculo esquelético adulto y en desarrollo. La mutación nula en GDF-8 en ratones transgénicos se caracteriza por una hipertrofia e hiperplasia marcada en el músculo esquelético (McPherron y col. (1997) Nature, 387: 83-90) . Son evidentes aumentos similares en la masa muscular esquelética en mutaciones naturales de GDF-8 en ganado bovino (Ashmore y col. (1974) Growth, 38: 501-507; Swatland y Kieffer (1994) J. Anim. Sci., 38: 752-757; McPherron y Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 124557-12461; y Kambadur y col. (1997) Genome Res., 7: 910-915) .Ya que el GDF-8 se expresa tanto en músculos adultos y en desarrollo, no está claro si regula la masa muscular durante el desarrollo o en adultos. Por lo tanto, la cuestión de si regula o no la masa muscular en adultos es importante desde una perspectiva terapéutica y científica. Los estudios recientes también han mostrado que la pérdida de masa muscular asociada con infección por VIH en seres humanos se acompaña de aumentos en la expresión de la proteína GDF-8 (González-Cadavid y col. (1998) PNAS, 95: 14938-43) . Además, GDF-8 puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatinin quinasa) y modula la proliferación celular de mioblastos (documento WO 00/43781) .

El documento WO98/33887 divulga un ratón transgénico knockout en GDF-8 y muestra que el ratón transgénico tiene tejido muscular aumentado. El documento WO98/33887 también divulga anticuerpos policlonales dirigidos a GDF-8 murina.

Un número de trastornos en seres humanos y animales se asocian con una pérdida o un impedimento funcional del tejido muscular, que incluye distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de pérdida de masa muscular, sarcopenia, y caquexia. Hasta la fecha, existen muy pocas terapias efectivas o fiables para estos trastornos. Sin embargo, los terribles síntomas asociados con estos trastornos pueden reducirse sustancialmente empleando terapias que aumenten la cantidad de tejido muscular en pacientes que padecen los trastornos. Aunque no curan las afecciones, dichas terapias podrían mejorar significativamente la calidad de vida para estos pacientes y podrían aliviar algunos de los efectos de estas enfermedades. Por tanto, existe una necesidad en la técnica para identificar nuevas terapias que puedan contribuir a un aumento general del tejido muscular en pacientes que padecen estos trastornos.

Además de sus propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento en el músculo esquelético, GDF-8 puede también estar involucrado en un número de otros procesos fisiológicos, incluyendo homeostasis de la glucosa en el desarrollo de la diabetes de tipo 2 y trastornos del tejido adiposo, como la obesidad. Por ejemplo, GDF-8 modula la diferenciación de preadipocitos a adipocitos (Kim y col. (2001) BBRC, 281: 902-906) .

También hay un número de afecciones asociadas con una pérdida de hueso, incluyendo osteoporosis, especialmente en las mujeres ancianas y/o postmenopáusicas. Las terapias actualmente disponibles para estas afecciones funcionan inhibiendo la resorción ósea. Sería deseable como alternativa a o además de estas terapias una terapia que promueva la formación de nuevo hueso.

Al igual que TGF-β-1, -2, y -3, la proteína GDF-8 se sintetiza como una proteína precursora que consiste en un propéptido amino terminal y un dominio maduro carboxilo terminal (McPherron y Lee, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461) . Antes de la escisión, la proteína GDF-8 precursora forma un homodímero. A continuación el propéptido amino terminal se escinde del dominio maduro. El propéptido escindido puede permanecer unido no covalentemente al dímero de dominio maduro, inactivando su actividad biológica (Miyazono y col. (1988) J. Biol.

Chem., 263: 6407-6415; Wakefield y col. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; y Brown y col. (1990) Growth Factors, 3: 35-43) . Se cree que dos propéptidos de GDF-8 se unen al dímero maduro de GDF-8 (Thies y col. (2001) Growth Factors, 18: 251-259) . Debido a su propiedad inactivante, el propéptido se conoce como el “péptido asociado a la latencia” (LAP) , y el complejo de dominio maduro y propéptido se cita comúnmente como el “complejo latente pequeño” (Gentr y y Nash (1990) Biochemistr y , 29: 6851-6857; Der y nck y col. (1995) Nature, 316: 701-705; y Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol., 12: 597-641) . También se sabe que otras proteínas se unen a GDF-8 o proteínas relacionadas estructuralmente e inhiben su actividad biológica. Dichas proteínas inhibidoras incluyen folistatina, y potencialmente, proteínas relacionadas con folistatina (Gamer y col. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232) . Se cree que el dominio maduro es activo como homodímero cuando se elimina el propéptido.

GDF-8 se encuentra elevadamente conservada en secuencia y función entre las distintas especies. La secuencia de aminoácidos de GDF-8 murina y humana es idéntica, al igual que el patrón de expresión de ARNm (McPherron y col. (1997) Nature 387: 83-90; González-Cadavid y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14938-14943) . Esta conservación de secuencia y función sugiere que la inhibición de GDF-8 en seres humanos es probable que tenga un efecto similar que la inhibición de GDF-8 en ratones.

GDF-8 se encuentra involucrada en la regulación de varios procesos biológicos críticos. Debido a su función clave en estos procesos, GDF-8 puede ser una diana deseable para intervención terapéutica. En particular, pueden emplearse agentes terapéuticos que inhiben la actividad de GDF-8 para tratar trastornos en seres humanos o animales en los que un aumento en el tejido muscular sería terapéuticamente beneficioso, en particular trastornos del tejido muscular y adiposo, enfermedades degenerativas del hueso, trastornos neuromusculares y diabetes como se discutió anteriormente.

Sumario de la invención La presente invención proporciona inhibidores de proteínas novedosos que comprenden anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que son reactivos específicamente con una proteína GDF-8 madura, tanto si se encuentra en forma monomérica, forma dimérica activa, o en complejo dentro del complejo latente de GDF-8. En una realización de la invención, los anticuerpos se unen a un epítopo sobre la proteína GDF-8 madura, que da como resultado una reducción de una o más de las actividades biológicas asociadas con GDF-8, en relación a una proteína GDF-8 madura que no está unida al mismo anticuerpo. En una realización de la invención, los anticuerpos divulgados en el presente documento reducen la actividad de GDF-8 asociada a la regulación negativa de la masa del músculo esquelético y/o densidad ósea.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento poseen propiedades biológicas únicas e inesperadas. Por ejemplo, un experto en la técnica podría típicamente esperarse que buenos... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a los aminoácidos 1 a 50 de SEC ID Nº : 15, en el que el anticuerpo reduce la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a los aminoácidos 1 a 25 de SEC ID Nº : 15.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a SEC ID Nº : 8.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a SEC ID Nº : 3.

5. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a SEC ID Nº : 18, en el que el anticuerpo reduce la actividad de GDF-8 asociada con una regulación negativa de la masa muscular esquelética.

6. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a SEC ID Nº : 5, en el que el anticuerpo reduce la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética.

7. El anticuerpo aislado de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo se une específicamente a SEC ID Nº : 2.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo se une específicamente a un complejo seleccionado del grupo de entre un complejo latente de GDF-8, GDF-8 en complejo con folistatina, y GDF8 en complejo con una proteína relacionada con folistatina.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo se une específicamente a un complejo latente de GDF-8.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el anticuerpo es un fragmento seleccionado de entre un anticuerpo de cadena sencilla, Fab, F (ab’) 2 y Fv.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el anticuerpo es quimérico.

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el anticuerpo está humanizado.

13. Un anticuerpo monoclonal aislado de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % idéntica a SEC ID Nº : 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a GDF-8 madura.

14. El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende al menos un CDR de cadena sencilla seleccionado de los aminoácido.

3. 35 de SEC ID Nº : 1, de los aminoácido.

5. 66 de SEC ID Nº : 1, y de los aminoácido.

9. 102 de SEC ID Nº : 1.

15. El anticuerpo de la reivindicación 13 o 14, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos un 90 % idéntica a SEC ID Nº : 1.

16. El anticuerpo de la reivindicación 15, en el que la secuencia de aminoácidos es SEC ID Nº : 1.

17. Un anticuerpo monoclonal aislado de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo al menos una CDR de cadena sencilla seleccionada de entre los aminoácido.

3. 35 de SEC ID Nº : 1, de los aminoácidos 5066 de SEC ID Nº : 1, y de los aminoácido.

9. 102 de SEC ID Nº : 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a GDF-8 madura.

18. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla.

19. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fab, F (ab’) 2 y Fv.

20. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-19, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

21. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-20, en el que el anticuerpo está humanizado.

22. Un anticuerpo aislado producido por una célula que tiene un Número de Designación de Depósito de ATCC PTA4236.

23. Un anticuerpo aislado que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo producido por una célula que tiene el Número de Designación de Depósito de ATCC PTA-4236.

24. Una célula que produce el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

25. Una célula con Número de Designación de Depósito de ATCC PTA-4236.

26. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

27. Un kit diagnóstico que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

28. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

29. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno médico en un mamífero.

30. El uso de la reivindicación 29, en el que el trastorno médico es un trastorno muscular.

31. El uso de la reivindicación 30, en el que el trastorno médico es distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad 10 pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de pérdida de masa muscular, sarcopenia o caquexia.

32. El uso de la reivindicación 30, en el que trastorno médico es distrofia muscular.

33. El uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 en la preparación de un medicamento.

34. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-23 en el que el anticuerpo se une específicamente a una proteína GDF-8 madura con mayor afinidad que a una proteína BMP-11 madura.