Anticuerpos humanos para CD20 humano y método para utilizar los mismos.

Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al CD20 humano y que es capaz de inducir una citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en una estirpe celular de célula B de linfoma de no Hodgkin con una concentración de anticuerpo de 1 nM o menor,

exhibe un EC50 de 0,2 nM o menos según se mide en células Daudi o un EC50 de 0,4 nM o menos según se mide en células RL y aumentar el tiempo de supervivencia libre de síntomas 9 veces o más cuando se administra por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a ratones injertados con estirpe celular Raji de linfoma de célula B de no Hodgkin, con relación a ratones SCID injertados con estirpe celular Raji de linfoma de célula B de no Hodgkin que recibe 10 mg/kg de un control Fc humano, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende:

- una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) y una CDR1 de cadena ligera (LCDR1), en donde la HCDR1 y LCDR1 son de la SEQ ID NO:341 y 349;

- una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una CDR2 de cadena ligera (LCDR2), en donde la HCDR2 y LCDR2 son de la SEQ ID NO: 343 y 351; y

- una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3), donde la HCDR3 y LCDR3 son de la SEQ ID NO:345 y 353;

Anticuerpos humanos para CD20 humano y método para utilizar los mismos Campo de la invención La presente invención se relaciona con anticuerpos humanos y con fragmentos de anticuerpos específicos para CD20 humano, con composiciones farmacéuticas y con métodos terapéuticos de los mismos.

Declaración de la técnica relacionada El CD20 (también conocido como antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humanos o Bp35; antígeno B1 de superficie de linfocitos B, Leu-16, BM5, y LF5) es una proteína de transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente ~35 kD expresado sobre linfocitos pre-B y B maduros (Valentine et al. (1989) , J. Biol. Chem., 264:11282; Einfield et al. (1988) , EMBO J., 7:711-717) . La secuencia de aminoácidos del CD20 humano aparece en la SEQ ID NO:1 (Aceso GenBank No. NP-690605) . Se describen anticuerpos anti-CD20, por ejemplo, en los documentos US 5, 736, 137, WO 2004/056312, y US 2004/0167319.

Los métodos para producir anticuerpos útiles como productos terapéuticos humanos incluyen la generación de anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (véase, por ejemplo, el documento US 6, 949, 245) . Véase también, por ejemplo, los documentos WO 94/02602 y US 6, 596, 541, que describen métodos para generar ratones genéticamente modificados capaces de producir anticuerpos útiles para fabricar productos terapéuticos humanos.

Breve resumen de la invención En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que une específicamente CD20 humano y es capaz de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en una estirpe celular de linfoma de célula B de no Hodgkin humana con una concentración de anticuerpo de 1 nM o menos, exhibe un EC50 de 0, 2 nM o menos como se mide en células Daudi, o un EC50 de 0, 4 nM o menos según se mide por células RL, y aumenta el tiempo de supervivencia libre de síntomas 9 veces o más cuando se administra por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a ratones injertados con la estirpe celular de linfoma de célula B de no Hodgkin humana Raji, relación con ratones SCID injertado con la línea de célula de linfoma de célula B de no Hodgkin humana Raji que reciben 10 mg/kg de un control Fc humano, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende:

-una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) y una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) , en donde el HCDR1 y LCDR1 son SEQ ID NO:341 y 349;

-una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) , en donde la HCDR2 y LCDR2 son SEQ ID NO:343 y 351; y

-una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) , en donde la HCDR3 y LCDR3 son SEQ ID NO:345 y 353.

Los anticuerpos proporcionados son anticuerpos humanos, preferiblemente anticuerpos humanos recombinantes que se unen específicamente al CD20 humano. Estos anticuerpos se caracterizan por unirse específicamente al CD20 humano y por mediar en la muerte de células de linfoma de células B que expresan el CD20. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender solo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F (ab’) 2 o scFv) , y se pueden modificar para efectuar funcionalidad, por ejemplo, para eliminar o potenciar funciones efectoras residuales (Reddy et al. (2000) , J. Immunol., 164:1925-1933) .

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente al CD20 humano y es capaz de inducir una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en células que expresan CD20 en presencia del complemento, en donde el anticuerpo a una concentración de aproximadamente 1 nM o menos induce 50% de lisis de células Daudi y RL en la presencia de suero humano normal al 5% con complemento. El anticuerpo o fragmento del mismo exhibe un EC50 de 0, 2 nM o menos, cuando se mide en células Daudi, o un EC50 de 0, 4 nM o menos cuando se mide en células RL. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de aumentar el tiempo de supervivencia libre de síntomas entre 9 veces o más, con relación a animales tratados con control en un modelo de ratón de linfoma humano.

El anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente al CD20 humano y es capaz de inducir una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de células que expresan CD20 en la presencia de células

mononucleares de sangre periférica (PBMC) , en donde el anticuerpo exhibe un EC50 de aproximadamente 0, 2 nM o menos, según se mide en células Daudi. En realizaciones preferidas, el anticuerpo exhibe un EC50 de aproximadamente 50 pM o menos; aproximadamente 20 pM o menos; de aproximadamente 10 pM o menos. En una realización preferida, los anticuerpos exhiben una actividad ADCC mejorada pueden comprender niveles reducidos de fucosilación, por ejemplo fucosa aproximadamente al 5%.

En una realización, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del anticuerpo de la invención comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) de la SEQ ID NO: 339, o una secuencia sustancialmente similar de la misma. En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento comprende la secuencia HCVR de la SEQ ID NO:339.

En una realización más específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende adicionalmente una secuencia de la región variable de cadena ligera (LCVR) de la SEQ ID NO: 347 o una secuencia sustancialmente similar de esta. En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento comprende la LCVR de la SEQ ID NO: 347.

En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende el par de secuencias HCVR/LCVR de la SEQ ID NO: 339/347.

En un segundo aspecto, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo. En realizaciones específicas, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR, en donde la secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 338, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma. En un aspecto relacionado, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una LCVR, en donde la secuencia es la SEQ ID NO: 346, o una secuencia sustancialmente idéntica a estas. En una realización preferida, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende una HCVR codificada por una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:338, una LCVR codificada por una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:346, respectivamente.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 345; y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 353. El anticuerpo o fragmento del mismo comprende como un par de secuencias de HCDR3 y LCDR3 de la SEQ ID NO: 345/353.

El anticuerpo o fragmento del mismo comprende adicionalmente una secuencia de dominico de CDR1 de cadena pesada (HCDR1) de la SEQ ID NO: 341; una secuencia de dominio de CDR2 de cadena pesada (HCDR2) de la SEQ ID NO: 343; una secuencia de dominio de la CDR1 de cadena ligera (LCDR1) de la SEQ ID NO: 349; y una secuencia de dominio de la CDR2 de cadena ligera (LCDR2) de la SEQ ID NO: 351. El anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de las SEQ ID NO: 341, 343, 345, 349, 351 y 353.

En un cuarto aspecto, la invención consta moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de la invención, en donde las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un dominio HCDR3 y un dominio LCDR3 son 344 y 352; respectivamente.

En un sexto aspecto, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que llevan las moléculas de ácidos nucleicos de la invención, y células anfitrionas en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos para fabricar los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención obtenida al cultivar las células anfitrionas de la invención. Por lo tanto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención. La invención proporciona adicionalmente un método para producir un anticuerpo CD20 anti-humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende las etapas de introducir el vector de expresión de la invención en una célula anfitriona aislada, hace crecer la célula bajo condiciones que permiten la producción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y recuperar el anticuerpo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al CD20 humano y que es capaz de inducir una citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en una estirpe celular de célula B de linfoma de no Hodgkin con una concentración de anticuerpo de 1 nM o menor, exhibe un EC50 de 0, 2 nM

o menos según se mide en células Daudi o un EC50 de 0, 4 nM o menos según se mide en células RL y aumentar el tiempo de supervivencia libre de síntomas 9 veces o más cuando se administra por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a ratones injertados con estirpe celular Raji de linfoma de célula B de no Hodgkin, con relación a ratones SCID injertados con estirpe celular Raji de linfoma de célula B de no Hodgkin que recibe 10 mg/kg de un control Fc humano, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende:

-una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) y una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) , en donde la HCDR1 y LCDR1 son de la SEQ ID NO:341 y 349;

-una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) , en donde la HCDR2 y LCDR2 son de la SEQ ID NO: 343 y 351; y

-una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) , donde la HCDR3 y LCDR3 son de la SEQ ID NO:345 y 353;

2. Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al CD20 humano y que es capaz de inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 5 nM o menor, en una estirpe celular de linfoma de célula B de no Hodgkin, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) y una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR) , en donde que las secuencias de HCVR y LCVR son de la SEQ ID NO: 339 y 347.

3. El anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde la concentración de anticuerpo requerida para inducir CDC es 1 nM o menor.

4. El anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 3, se caracteriza adicionalmente por exhibir un EC50 de 0, 2 nM o menor, según se mide en células Daudi, o un EC50 de 0, 4 nM o menor, que se mide mediante células RL.

5. Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza por exhibir un KD o EC50 de por lo menos 10-11 M, cuando se mide mediante unión al antígeno presentado sobre la superficie celular.

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un método para producir un anticuerpo anti-CD20 humano o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende las etapas de introducir el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 en una célula anfitriona aislada, cultivar la célula bajo condiciones que permiten la producción del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo, y recuperar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido de esta manera.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la célula anfitriona es una célula E. coli, una célula CHO,

o una célula COS.

10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por CD20 en un humano, en donde la enfermedad o afección se selecciona de linfoma no Hodgkin, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, leucemia linfocítica crónica, y enfermedades inflamatorias.

12. Uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la fabricación de un medicamento para uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por CD20 en un humano, en donde la enfermedad o afección se selecciona del grupo que

consiste de linfoma no Hodgkin, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, leucemia linfocítica crónica, y enfermedades inflamatorias.