Anticuerpos anti-MIF.

Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la región que se abarca los aa 50-68 o la región que abarca los aa 86-102 de MIF humano,

e inhibe la función biológica de MIF humano.

Anticuerpos anti-MIF Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y a partes de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a la región C-terminal o central del factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF). Estos anticuerpos anti-MIF y partes de unión a antígeno de los mismos inhiben además la función biológica de MIF humano. La invención también se refiere a lineas celulares aisladas que producen anticuerpos anti-MIF y a moléculas de ácido nucleico que codifican para tales inmunoglobulinas. La presente invención también se refiere a un método de identificación de anticuerpos anti-MIF, a composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos y a un método de uso de estos anticuerpos y composiciones para el tratamiento de estados relacionados con MIF.

Antecedentes

El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) es una citocina aislada inicialmente basándose en su capacidad para inhibir la migración de macrófagos aleatoria in vitro (Bloom et al. Science 1966, 153, 8-2; David et al. PNAS 1966, 56, 72-7). Aunque se ha conocido MIF desde 1966, no se conoce su función exacta en la mayoría de células, pero parece que MIF es un regulador posterior critico de la respuesta inmunitaria innata y adquirida.

El ADNc de MIF humano se clonó en 1989 (Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6), y su ubicación genómica se mapeó en el cromosoma 22. El producto del gen de MIF es una protelna de aminoácidos con una masa molecular de 12,5 kDa. La proteína está altamente conservada con una homología de secuencia entre MIF humano, de ratón, de rata y bovino de entre el 9 - 96%. Sin embargo, MIF no tiene ninguna homología de secuencia significativa con ninguna otra proteína. La estructura tridimensional de MIF es distinta de cualquier otra citocina u hormona hipofisaria. La proteína cristaliza como un trímero de subunidades idénticas. Cada monómero contiene dos hélices alfa antiparalelas que se empaquetan frente a una lámina beta de cuatro hebras. El monómero tiene dos hebras beta adicionales que interaccionan con las láminas beta de subunidades adyacentes para formar la superficie de contacto entre monómeros. Las tres láminas beta se disponen para formar un barril que contiene un canal accesible por disolvente que discurre a través del centro de la proteína a lo largo de un eje triple molecular (Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196).

Se notificó que se indujo la secreción de MIF a partir de macrófagos a concentraciones muy bajas de glucocorticoide (Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71). Sin embargo, como citocina proinflamatoria, MIF también contrarregula los efectos de glucocorticoides y estimula la secreción de otras citocinas tales como el factor de necrosis tumoral TNF-a e interleucina IL-ip (Baugh et al, Crit Care Med 22, 3, S27-35) asumiendo por tanto un papel en la patogenia de enfermedades inflamatorias e inmunitarlas. MIF también se asocia directamente con el crecimiento de linfoma, melanoma y cáncer de colon (Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2, 2: 751-62).

MIF es un mediador de muchos estados patológicos y por tanto se asocia con una variedad de enfermedades incluyendo enfermedad inflamatoria del intestino (Eli), artritis reumatoide (AR), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), asma, glomerulonefritis, nefropatía por IgA, cáncer, infarto de miocardio (IM) y septicemia.

Se han desarrollado anticuerpos anti-MIF monoclonales y policlonales frente a MIF humano recombinante (Shimizu et al., FEBS Lett. 1996; 381, 199-22; Kawaguchi et al., J. Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232 y Weiser et al., Cell. Immunol. 1985, 9, 167-78).

Se han sugerido anticuerpos anti-MIF para su uso terapéutico para inhibir la liberación de TNF-a. Se notifica que Calandra et al., (J. Inflamm. 1995. 47, 39-51) usaron anticuerpos anti-MIF para proteger animales frente a choque séptico Inducido experimentalmente por bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Se sugirieron anticuerpos anti- MIF como medios de terapia para modular la producción de citocinas en choque séptico y otros estados patológicos Inflamatorios.

El documento US 6.645.493 da a conocer anticuerpos anti-MIF monoclonales derivados a partir de células de hlbrldoma, que neutralizan la actividad biológica de MIF. Pudo mostrarse en un modelo animal que estos anticuerpos anti-MIF derivados de ratón tenían un efecto beneficioso en el tratamiento de choque inducido por endotoxinas. Algunos de los anticuerpos anti-MIF descritos (III.D.9, XIV.14.3 y XIV.15.5) se usaron en la presente invención para experimentos comparativos.

El documento US 23/235584 da a conocer métodos de preparación de anticuerpos de alta afinidad frente a MIF en animales en los que se ha desactivado de manera homocigótica el gen de MIF.

El factor inhibidor de la glicosilación (GIF) es una proteína descrita por Galat et al. (Eur. J. Biochem. 1994, 224, 417-21). Se reconoce ahora que MIF y GIF son idénticos. Watarai et al. (PNAS 2, 97, 13251-6) describieron

anticuerpos policlonales que se unen a diferentes epítopos de GIF para identificar la naturaleza bioquímica de la modificación postraduccional de GIF en células T. Watarai et al (PNAS 2, 97, 13251-6) notificaron que GIF se produce en diferentes isoformas conformacionales in vitro. Un tipo de isómero se produce mediante modificación química de un único residuo de cisteína. La modificación química conduce a cambios conformacionales dentro de la proteína GIF y cambia su función biológica.

Se conocen en general anticuerpos anti-MIF. Se hace referencia, a modo de ejemplo, al documento US 23/99653 que da a conocer, por ejemplo, el anticuerpo III.D.9.

Este anticuerpo también se conoce a partir de varios documentos adicionales. Véanse, por ejemplo, el documento US 24/156848 y el documento WO 98/17314 así como el documento USA 6.3.615. Los documentos también se refieren, por ejemplo, al anticuerpo XIV.14.3. Estos anticuerpos no se unen al mismo epítopo que los anticuerpos de la invención actualmente reivindicados. También se hace referencia a Zang et al., International Immunol. Pharmacology 211, DOI:.116/J.INTIMP.211.4.17 que dan a conocer 8 anticuerpos frente a la molécula de MIF, todos los cuales se unen a la parte N-terminal de la molécula de MIF.

Incluso basándose en esta documentación, existe la necesidad de anticuerpos anti-MIF adlcionalmente mejorados.

Dada la complejidad de la participación de MIF en diversas enfermedades, se desea sumamente una aclaración de la función de anticuerpos anti-MIF específicos de epítopo y de su uso para enfoques terapéuticos. Por tanto, existe la necesidad de anticuerpos anti-MIF específicos de epítopo, que inhiban la función biológica de MIF humano para el tratamiento de enfermedades y estados mediados por MIF.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos y a partes de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a la región C-terminal o central del factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), tal como se define en las reivindicaciones.

La invención se refiere además a moléculas de ácido nucleico que codifican para estos anticuerpos o partes de unión a antígeno de los mismos, así como a vectores que comprenden un ácido nucleico de este tipo y a células huésped que comprenden un vector de este tipo, así como a métodos para la producción recombinante de polipéptidos codificados por moléculas de ácido nucleico.

La Invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-MIF o una parte de unión a antígeno del mismo. La composición farmacéutica también puede contener un portador farmacéuticamente aceptable u otros agentes terapéuticos.

La Invención también se refiere al uso de un anticuerpo anti-MIF o una parte de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inmunológicas tales como enfermedades Inflamatorias y trastornos hiperproliferativos.

La Invención se refiere además a un anticuerpo anti-MIF o una parte de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento de enfermedades inmunológicas tales como enfermedades inflamatorias y trastornos hiperproliferativos.

La Invención se refiere además a un procedimiento para la identificación de un anticuerpo anti-MIF que puede inhibir MIF activo e inducir un efecto beneficioso en un modelo animal.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: muestra la secuencia de aminoácidos de la reglón variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MIF humano de la invención.

Figura 2: muestra la secuencia de aminoácidos de la reglón variable... [Seguir leyendo]

Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la región que se abarca los aa 5-68 o la región que abarca los aa 86-12 de MIF humano, e Inhibe la función biológica de MIF humano.

Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno presenta al menos una de las siguientes propiedades:

a) inhibe la actividad de anulación de glucocorticoides (GCO),

b) inhibe la proliferación de células cancerosas o fibroblastos,

c) se une a MIF activo,

d) no se une a MIF no activo.

Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o dicha parte de unión a antígeno se une a MIF activo.

Anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo Bax69, en el que se define que el anticuerpo Bax69 tiene una secuencia de ácido nucleico en VL de SEQ ID NO: 14 y una secuencia de ácido nucleico en Vh de SEQ ID NO: 2, anticuerpo Bax94, en el que se define que el anticuerpo Bax94 tiene una secuencia de ácido nucleico en VL de SEQ ID NO: 16 y una secuencia de ácido nucleico en VH de SEQ ID NO: 22, anticuerpo Bax152, en el que se define que el anticuerpo Bax152 tiene una secuencia de ácido nucleico en VL de SEQ ID NO: 17 y una secuencia de ácido nucleico en Vh de SEQ ID NO: 23, y anticuerpo BaxA1, en el que se define que el anticuerpo BaxA1 tiene una secuencia de ácido nucleico en Vl de SEQ ID NO: 18 y una secuencia de ácido nucleico en Vh de SEQ ID NO: 24.

Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo lgG4, y en el que dicha lgG4 tiene una única mutación, mediante lo cual la subsecuencia CPSC en la región Fe de lgG4 se vuelve CPPC.

Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno comprende:

a) una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cadena pesada seleccionadas independientemente de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo Bax69, anticuerpo Bax94, anticuerpo Bax152 y anticuerpo BaxA1, todos tal como se definieron anteriormente,

b) una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cadena ligera seleccionadas independientemente de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo Bax69, anticuerpo Bax94, anticuerpo Bax152 y anticuerpo BaxA1, todos tal como se definieron anteriormente, o en el que el anticuerpo comprende:

c) una secuencia de Vh que es idéntica en al menos el 9% a la secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo Bax69, el anticuerpo Bax94, el anticuerpo Bax152 y el anticuerpo BaxA1, todos tal como se definieron anteriormente,

d) una secuencia de VL que es idéntica en al menos el 9% a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera del anticuerpo Bax69, el anticuerpo Bax94, el anticuerpo Bax152 y el anticuerpo BaxA1 todos tal como se definieron anteriormente.

Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inmunológica, en el que dicha enfermedad inmunológica es una enfermedad inflamatoria, o un trastorno hiperproliferativo.

Anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno según la reivindicación 7, en el que dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en vasculitis, artritis, septicemia, choque séptico, choque endotóxico, síndrome del choque tóxico, síndrome de dificultad respiratoria adquirida, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, peritonitis, nefritis y psoriasis.

Composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo monoclonal o la parte de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un portador farmacéuticamente aceptable.

1. Línea celular aislada que produce el anticuerpo monoclonal o la parte de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótldos que codifica para el

anticuerpo monoclonal o la parte de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11, en el que el vector comprende una secuencia de control de la expresión unida operativamente a dicha molécula de ácido nucleico.

13. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 12, o la molécula de ácido nucleico según

la reivindicación 11.

14.

Método de producción de un anticuerpo monoclonal o una parte de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 13 o la línea celular según la reivindicación 1 en condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo.

Procedimiento para la identificación de anticuerpos anti-MIF que pueden inhibir la función biológica de MIF humano e inducir un efecto beneficioso en un modelo animal llevando a cabo las siguientes etapas:

a) seleccionar un anticuerpo que se une a MIF activo y no se une a MIF no activo,

b) someter a prueba dicho anticuerpo en ensayos in vitro,

c) seleccionar un anticuerpo que inhibe GCO y/o la proliferación celular.