Xilanasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para elaborarlas y purificarlas.

Un ácido nucleico, sintético o recombinante, aislado que comprende:

(a) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad xilanasa, donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o tiene 100% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 159, o que codifica un fragmento enzimáticamente activo del polipéptido;

(b) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad xilanasa, donde el ácido nucleico comprende una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 159;

donde las condiciones restrictivas comprenden una etapa de lavado que comprende un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de alrededor de 65°C durante alrededor de 15 minutos;

(c) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad xilanasa, donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 160;

o

(d) un ácido nucleico que comprende una secuencia completamente complementaria a cualquiera de (a) a (c); donde la actividad xilanasa comprende una capacidad para reducir la demanda ClO2 cuando se utiliza para pretratar pasta Kraft.

Xilanasas, Ácidos Nucleicos que las Codifican y Métodos para Elaborarlas y Purificarlas

Referencia Cruzada a Publicaciones Relacionadas 5

Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad bajo 35 U.S.C. § 119 (e) de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/389, 299, presentada el 14 de Junio de 2002. La solicitud anteriormente mencionada se incorpora a la presente memoria explícitamente como referencia en su totalidad y para todos los fines.

Campo de la Invención

Esta invención se refiere generalmente a enzimas, polinucleótidos que codifican las enzimas, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos y más específicamente a enzimas que tienen actividad xilanasa, p. ej., que catalizan la hidrólisis de enlaces xiloxídicos β-1, 4 internos o enlaces endo-β-1, 4-glucanasa. 15

Antecedentes

Las xilanasas (p. ej., endo-1, 4-beta-xilanasa, EC 3.2.1.8) hidrolizan enlaces β-1, 4-xilosídicos internos en el xilano para producir oligómeros de xilosa y xilo de peso molecular más bajo. Los xilanos son polisacáridos formados a 20 partir de D-xilopiranosas unidas por 1, 4-β-glicósidos. Las xilanasas tienen un valor comercial considerable, utilizándose en la industria alimentaria, para panificación y tratamiento de frutas y vegetales, descomposición de residuos agrícolas, en la fabricación de piensos para animales y en la producción de pasta y papel. Las xilanasas son formadas por hongos y bacterias.

Las arabinoxilanasas son los polisacáridos principales de los cereales aparte del almidón representando 2, 5 – 7, 1% p/p dependiendo de la variedad y las condiciones de crecimiento. Las propiedades fisicoquímicas de este polisacárido son tales que dan lugar a soluciones viscosas o incluso geles en condiciones oxidativas. Además, los arabinoxilanos tienen una alta capacidad de unirse a agua y pueden tener un papel en la estabilidad de la espuma de proteína. Todas estas características presentan problemas para varias industrias incluyendo la elaboración de 30 cerveza, panificación, nutrición animal y fabricación de papel. En las aplicaciones para la elaboración de cerveza, la presencia de xilano da como resultado problemas en la filtrabilidad de la malta y la formación de turbidez. En las aplicaciones para panificación (especialmente para galletas y galletas saladas) , estos arabinoxilanos crean masas pegajosas y son difíciles de trabajar y reducen el tamaño de la galleta. Además, este carbohidrato está implicado en la rehidratación rápida del producto horneado dando como resultado la pérdida del carácter crujiente y la reducción 35 de vida útil. Para aplicaciones de alimentación de animales monogástricos con dietas de cereales, el arabinoxilano es el factor que más contribuye a la viscosidad del contenido de los intestinos y por lo tanto afecta adversamente a la digestibilidad del alimento y al ritmo de crecimiento del animal. Para animales rumiantes, estos polisacáridos representan componentes sustanciales de la ingesta de fibra y la digestión más completa de los arabinoxilanos facilitaría eficiencias de conversión de alimentos superiores. 40

Las xilanasas se utilizan en la actualidad como aditivos (acondicionadores de masas) en el procesamiento de masas para la hidrólisis del arabinoxilano soluble en agua. En aplicaciones para panificación (especialmente para galletas y galletas saladas) , el arabinoxilano crea masas pegajosas que son difíciles de trabajar y reduce el tamaño de la galleta. Además, este carbohidrato está implicado en la rehidratación rápida del producto horneado dando como 45 resultado la pérdida del carácter crujiente y la reducción de la vida útil.

La potenciación de la digestión del xilano en los piensos para animales puede mejorar la disponibilidad y la digestibilidad de los valiosos nutrientes carbohidratados y proteicos del alimento. Para aplicaciones en alimentos para animales monogástricos con dietas de cereales, el arabinoxilano es el factor que más contribuye a la viscosidad 50 del contenido del intestino y de ese modo afecta adversamente a la digestibilidad del alimento y la tasa de crecimiento del animal. Para animales rumiantes, estos polisacáridos representan los componentes esenciales de la ingesta de fibra y una digestión más completa facilitaría mayores eficiencias de conversión de alimento. Es deseable que las xilanasas de los piensos para animales sean activas en el estómago del animal. Esto requiere una enzima alimentaria que tenga alta actividad a 37°C y a pH bajo para animales monogástricos (pH 2-4) y casi pH neutro para 55 rumiantes (pH 6, 5-7) . La enzima debe poseer también resistencia a las xilanasas del intestino del animal y estabilidad a las temperaturas más altas implicadas en la peletización del alimento. En esencia, existe la necesidad en la técnica de aditivos alimentarios con xilanasa para alimento monogástrico con alta actividad específica, actividad a 35-40°C y pH 2-4, vida media superior a 30 minutos en SGF y una vida media > 5 minutos a 85°C en estado formulado. Para alimento de rumiantes, existe la necesidad de aditivos para alimento con xilanasa que 60 tengan una alta actividad específica, actividad a 35-40°C y pH de 6, 5-7, 0, vida media superior a 30 minutos en SRF y estabilidad en forma de polvo seco concentrado.

Las xilanasas se utilizan también en muchas otras aplicaciones. Por ejemplo, las xilanasas se utilizan para mejorar la calidad y cantidad de proteína láctea en vacas en período de lactación (véase, por ejemplo, Kung, L., et al, J. Dair y Science, 2000 Jan 83:115-122) , incrementando la cantidad de sacáridos solubles en el estómago y el intestino delgado de cerdos (véase, por ejemplo, van der Meulen, J. et al, Arch. Tieremahr, 2001 54:101-115) , mejorando la eficacia de la producción tardía de huevos y la producción de huevos en gallinas (véase, por ejemplo, Jaroni, D., et 5 al, Poult. Sci., 1999 June 78:841-847) . Adicionalmente, se ha demostrado que las xilanasas son útiles en el blanqueo biológico y el tratamiento de las pastas de papel (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.202.249) , el blanqueo biológico y el tratamiento de las pastas de madera y papel (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.179.021, 5.116.746, 5.407.827, 5.405.769, 5.395.765, 5.369.024, 5.457.045, 5.434.071, 5.498.534, 5.591.304, 5.645.686, 5.725.732, 5.759.840, 5.834.301, 5.871.730 y 6.057.438) 10 para reducir el contenido de lignina de la madera y modificar la madera (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.486.468 y 5.770.012) como mejoradores de harinas, masas y pan (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.108.765 y 5.306.633) como aditivos y/o suplementos alimentarios, como se ha mostrado anteriormente (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.432.074, 5.429.828, 5.612.055, 5.720.971, 5.981.233, 5.948.667, 6.099.844, 6.132.727 y 6.132.716) , en la fabricación de soluciones de 15 celulosa (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.760.211) . Las composiciones detergentes que tienen actividad xilanasa se utilizan para compuestos de frutas, hortalizas y/o barro y arcilla (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.786.316) .

Las xilanasas también son útiles en un método de uso y composición de una carbohidrasa y/o una xilanasa para la 20 fabricación de un agente para los tratamientos y/o profilaxis de la coccidiosis. El agente manufacturado puede estar en forma de un pienso para animales basado en cereales (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.624.678) . Los usos adicionales de las xilanasas incluyen el uso en la producción de fibra dietética soluble en agua (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.622.738) , para mejorar la filtrabilidad, la separación y la producción de almidón (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.960.705 y 25 5.023.176) , en el sector de las bebidas para mejorar filtrabilidad del mosto o la cerveza (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.746.517) , en una composición enzimática para promover la secreción de leche de ganaderías y mejorar la calidad de la leche (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.144.354) , para reducir la viscosidad de material vegetal (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.874.274) , para incrementar la viscosidad o la capacidad de gelificación de productos alimenticios tales como 30 confituras, mermeladas, jaleas, zumos, pastas, sopas, salsas, etc. (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.036.981) . Las xilanasas se pueden utilizar también en la hidrólisis de hemicelulosa... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico, sintético o recombinante, aislado que comprende:

(a) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad xilanasa, donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o 5 tiene 100% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 159, o que codifica un fragmento enzimáticamente activo del polipéptido;

(b) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad xilanasa, donde el ácido nucleico comprende una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con un ácido nucleico que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 159; 10

donde las condiciones restrictivas comprenden una etapa de lavado que comprende un lavado en 0, 2X SSC a una temperatura de alrededor de 65°C durante alrededor de 15 minutos;

(c) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad xilanasa, donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 160;

o 15

(d) un ácido nucleico que comprende una secuencia completamente complementaria a cualquiera de (a) a (c) ;

donde la actividad xilanasa comprende una capacidad para reducir la demanda ClO2 cuando se utiliza para pretratar pasta Kraft.

2. Un ácido nucleico sintético o recombinante, aislado que comprende un ácido nucleico del SEQ ID NO 159, donde 20 el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad xilanasa.

3. El ácido nucleico de reivindicación 1 o 2 que codifica una xilanasa que carece de una secuencia señal o modulo de unión a carbohidrato.

4. El ácido nucleico de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3 que codifica una xilanasa y que comprende adicionalmente una secuencia heteróloga no asociada naturalmente con el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El ácido nucleico de reivindicación 4, donde la secuencia heteróloga comprende: una secuencia señal, un modulo 30 de unión a carbohidrato, un dominio catalítico (CD) , una secuencia conectora, un dominio de detección o purificación, o una de sus combinaciones.

6. Una sonda de ácido nucleico para identificar, detectar o aislar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad xilanasa, donde la sonda comprende la secuencia de reivindicación 1 o 2, 35

donde la sonda identifica, detecta o aísla el ácido nucleico mediante unión o hibridación.

7. Un par de cebadores de amplificación, donde el par de cebadores comprende un primer miembro que tiene una secuencia como la mostrada mediante al menos alrededor de 10 a 50 bases consecutivas de, o alrededor de los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más residuos de la 40 secuencia de reivindicación 1 o 2;

y un segundo miembro que tiene una secuencia como la mostrada mediante al menos alrededor de 10 a 50 bases de la hebra complementaria consecutivas del primer miembro, o alrededor de los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más residuos de la hebra complementaria del primer miembro.

8. Un ácido nucleico que codifica una xilanasa recombinante generado mediante amplificación de un polinucleótido utilizando un par de cebadores de amplificación que comprende un par de cebadores de amplificación como los mostrados en la reivindicación 7, donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad xilanasa que comprende una capacidad para reducir la demanda de ClO2 cuando se utiliza para pretratar pasta Kraft. 50

9. Una xilanasa sintética o recombinante, aislada codificada por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Un método para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad xilanasa que 55 comprende la amplificación de un ácido nucleico molde con un par de cebadores de amplificación capaces de amplificar la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, o una subsecuencia del mismo; donde el par de cebadores de amplificación comprende el par de cebadores de amplificación de la reivindicación 7.

11. Un casete de expresión, un vector o un vehículo de clonación que comprende un ácido nucleico que 60 comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

12. Una célula transformada que comprende:

(a) la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2;

(b) el casete de expresión casete de expresión, vector o vehículo de clonación de la reivindicación 11;

(c) un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 14.

13. Un animal no humano transgénico o planta transgénica o grano transgénico que comprende:

(a) la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; 5

(b) el casete de expresión casete de expresión, vector o vehículo de clonación de la reivindicación 11;

(c) un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 14.

14. Un polipéptido sintético o recombinante, aislado que tiene actividad xilanasa, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos: 10

(a) que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o tiene 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 160, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma, donde la actividad xilanasa comprende una capacidad para reducir la demanda de ClO2 cuando se utiliza para pretratar pasta Kraft; o (b) codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia como la mostrada en la reivindicación 1 o 2. 15

15. Un polipéptido sintético o recombinante, aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 160, donde el polipéptido tiene actividad xilanasa.

16. El polipéptido de la reivindicación 14 o 15, pero que carece de una secuencia señal o modulo de unión a 20 carbohidrato.

17. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que comprende adicionalmente una secuencia heteróloga no asociada naturalmente con el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.

18. El polipéptido de la reivindicación 17, donde la secuencia heteróloga comprende una secuencia señal, un modulo de unión a carbohidrato, un dominio catalítico (CD) , una secuencia conectora, un dominio de detección o purificación, o una de sus combinaciones.

19. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, que comprende adicionalmente al menos un sitio de 30 glicosilación.

20. Una preparación de proteína que comprende:

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2;

(b) el polipéptido de la reivindicación 14 o 15. 35

21. Un heterodímero que comprende (a) un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 o el polipéptido de la reivindicación 14 o 15; y (b) un segundo dominio.

22. Un homodímero que comprende (a) un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico de la 40 reivindicación 1 o 2; el polipéptido de la reivindicación 14 o 15; y (b) un segundo dominio.

23. Un polipéptido inmovilizado, donde el polipéptido comprende:

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2;

(b) el polipéptido de la reivindicación 14 o 15. 45

24. Una matriz, micromatriz, biochip o chip que comprende (a) el polipéptido inmovilizado de la reivindicación 23, o un ácido nucleico inmovilizado que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

25. Un anticuerpo sintético o recombinante, aislado que se une específicamente a un polipéptido:

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2;

(b) el polipéptido de la reivindicación 14 o 15.

26. A hibridoma que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido: 55

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2;

(b) el polipéptido de la reivindicación 14 o 15.

27. Un método de aislar o identificar un polipéptido con una actividad xilanasa que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un anticuerpo como se muestra en la reivindicación 25; (b) proporcionar una muestra que 60 comprende polipéptidos; y (c) poner en contacto la muestra de la etapa (b) con el anticuerpo de la etapa (a) en condiciones en las que el anticuerpo se puede unir específicamente al polipéptido, aislando o identificando de ese modo un polipéptido que tiene una actividad xilanasa.

28. Un método para elaborar un anticuerpo anti-xilanasa que comprende administrar a un animal no humano; (a) el ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, o una subsecuencia del mismo, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria humoral, elaborando de ese modo un anticuerpo anti-xilanasa; o, (b) un polipéptido de la reivindicación 14 o 15, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria humoral, elaborando de ese modo un anticuerpo anti-xilanasa. 5

29. Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico conectado operablemente a un promotor, donde el ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, o el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 14 o 15; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, produciendo de 10 ese modo un polipéptido recombinante.

30. El método de la reivindicación 29 que comprende adicionalmente transformar una célula anfitriona con el ácido nucleico de la etapa (a) seguido de la expresión del ácido nucleico de la etapa (a) , produciendo de ese modo un polipéptido recombinante en una célula transformada. 15

31. Un método para identificar un sustrato de xilanasa que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 14 o 15, o codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; (b) proporcionar un sustrato de ensayo; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con el sustrato de ensayo de la etapa (b) y detectar un descenso en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de producto 20 de reacción, donde un descenso en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción identifica el sustrato de ensayo como un sustrato de xilanasa.

32. Un método para determinar si un compuesto de ensayo se une específicamente a un polipéptido que comprende las siguientes etapas: 25

(A) (a) expresar un ácido nucleico o un vector que comprende el ácido nucleico en condiciones permisivas para la traducción del ácido nucleico a un polipéptido, donde el ácido nucleico tiene la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de ensayo; y (d) determinar si el compuesto de ensayo de la etapa (b) se une específicamente al polipéptido; o, 30

(B) (a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 14 o 15; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de ensayo; y (d) determinar si el compuesto de ensayo de la etapa (b) se une específicamente al polipéptido.

33. Un método para identificar un modulador de una actividad xilanasa que comprende las siguientes etapas: 35 (a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 14 o 15; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con el compuesto de ensayo de la etapa (b) y medir una actividad de la xilanasa, donde un cambio en la actividad xilanasa medida en presencia del compuesto de ensayo en comparación con la actividad en ausencia del compuesto de ensayo proporciona una determinación de que el compuesto de ensayo modula la actividad xilanasa. 40

34. Un método para aislar, detectar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad xilanasa de una muestra que comprende las etapas de:

(a) proporcionar el par de cebadores de amplificación de la reivindicación 7 o la sonda de la reivindicación 6; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra o tratar la muestra de manera que el ácido nucleico en la muestra sea 45 accesible para la hibridación al par de cebadores de amplificación o sonda; y, (c) combinar el ácido nucleico de la etapa (b) con el par de cebadores de amplificación o sonda de la etapa (a) y amplificar o identificar un ácido nucleico de la muestra, aislando, detectando o recuperando de este modo un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad xilanasa a partir de la muestra.

35. Un método para incrementar la termotolerancia o termoestabilidad de una xilanasa, comprendiendo el método la glicosilación una xilanasa, donde la xilanasa comprende al menos 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 o más residuos de aminoácidos continuos de un polipéptido que tiene una actividad xilanasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 14 o 15, incrementando de ese modo la termotolerancia o termoestabilidad de la xilanasa. 55

36. Un método para elaborar una molécula pequeña que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas biosintéticas capaces de sintetizar o modificar una molécula pequeña, donde una de las enzimas comprende una enzima xilanasa codificada por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; (b) proporcionar un sustrato para al menos una de las enzimas de la etapa (a) ; y (c) hacer reaccionar el sustrato de la 60 etapa (b) con las enzimas en condiciones que faciliten una pluralidad de reacciones biocatalíticas para generar una molécula pequeña mediante una serie de reacciones biocatalíticas.

37. Un método para modificar una molécula pequeña que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una enzima xilanasa, donde la enzima comprende un polipéptido la secuencia de aminoácidos de la reivindicación de la reivindicación 14 o 15, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; (b) proporcionar un molécula pequeña; y (c) hacer reaccionar la enzima de la etapa (a) con la molécula pequeña de la etapa (b) en condiciones que faciliten una reacción enzimática catalizada 5 por la enzima xilanasa, modificando de ese modo una molécula pequeña by una reacción enzimática de xilanasa.

38. Un método para producir una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de xilanasa modificados o sitios de unión al sustrato, donde los sitios activos modificados o sitios de unión al sustrato derivan de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio 10 activo o un primer sitio de unión al sustrato comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica un primer sitio activo o primer sitio de unión al sustrato, donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, y el ácido nucleico codifica un sitio activo de xilanasa o un sitio de unión al sustrato de xilanasa;

(b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifican variantes de aminoácidos de origen 15 natural a una pluralidad de codones elegidos como diana en el primer ácido nucleico; y,

(c) utilizar el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de ácidos nucleicos variantes que codifican el sitio activo o codifican el sitio de unión al sustrato que codifican una variedad de variaciones de aminoácido en cada codón de aminoácido que fue mutagenizado, produciendo de ese modo una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de xilanasa modificados o sitios de unión al 20 sustrato.

39. Un método para determinar un fragmento funcional de una enzima xilanasa que comprende las etapas de: (a) proporcionar una enzima xilanasa, donde la enzima comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 14 o 15, o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la 25 reivindicación 1 o 2; y, (b) suprimir una pluralidad de residuos de aminoácidos de la secuencia de la etapa (a) y someter a ensayo la subsecuencia restante para determinar una actividad xilanasa, determinando de ese modo un fragmento funcional de una enzima xilanasa.

40. Un método para construir una célula completa de fenotipos nuevos o modificados utilizando análisis de 30 flujo metabólico en tiempo real, comprendiendo el método las siguientes etapas: (a) elaborar una célula modificada modificando la composición genética de una célula, donde la composición genética es modificada mediante la adición a la célula de un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; (b) cultivar la célula modificada para generar una pluralidad de células modificadas; (c) medir al menos un parámetro metabólico de la célula controlando el cultivo celular de la etapa (b) en tiempo real; y, (d) analizar los datos de la 35 etapa (c) para determinar si el parámetro método difiere de una medición comparable en una célula no modificada en condiciones similares, identificando de ese modo un fenotipo construido en la célula utilizando análisis de flujo metabólico en tiempo real.

41. Un método para expresar en exceso una xilanasa recombinante en una célula que comprende expresar un 40 vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

42. Un método para elaborar una planta transgénica que comprende las siguientes etapas:

(a) introducir una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula, donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; (b) producir una planta 45 transgénica a partir de la célula transformada.

43. Un método para expresar una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula vegetal que comprende las siguientes etapas: (a) transformar la célula vegetal con una secuencia de ácido nucleico heteróloga conectado operablemente a un promotor, donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga comprende la secuencia 50 de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; (b) cultivar la planta en condiciones en las que la secuencia de ácido nucleico heteróloga se exprese en la célula vegetal.

44. Un método para hidrolizar, romper o desorganizar una composición que comprende xilano que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 14 o 15, o un polipéptido que 55 tiene una actividad xilanasa codificada por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; (b) proporcionar un composición que comprende un xilano; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que la xilanasa hidroliza, rompe o desorganiza la composición que comprende xilano.

45. Un método para reducir lignina en una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, que comprende: (i) poner en contacto la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, el producto de pasta de papel, o una de sus combinaciones, con al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

46. Un método para reducir una lignina en una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, en condiciones 5 de alta temperatura y de pH alcalino, comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) proporcionar al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2;

(b) proporcionar:

(i) una composición que comprende una madera, producto de madera, pasta de madera, pasta Kraft, papel, 10 producto de papel, pasta de papel que comprenden lignina o una de sus combinaciones, o (ii) una composición que comprende una madera blanda y/o una madera dura, o derivada de una madera blanda y/o una madera dura; y

(c) poner en contacto la composición de (b) con el polipéptido de la etapa (a) en condiciones que comprenden una temperatura d.

6. 85°C y pH 10, donde el polipéptido reduce la lignina en la madera, el producto de 15 madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel, o una de sus combinaciones, o (d) el método de (c) , donde el polipéptido cataliza la degradación de un enlace de hemicelulosa de la lignina en la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel, o una de sus combinaciones, liberando de ese modo lignina. 20

47. Un método para tratar una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, en condiciones de alta temperatura y pH alcalino, comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) proporcionar al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la 25 secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2;

(b) proporcionar

(i) una composición que comprende una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel o una de sus combinaciones, o (ii) una composición que comprende una madera blanda y/o una madera dura, o derivada de una madera 30 blanda y/o una madera dura; y

(c) poner en contacto la composición de (b) con el polipéptido de la etapa (a) en condiciones que comprenden una temperatura d.

6. 85°C y pH 10, donde el polipéptido cataliza la hidrólisis de los compuestos en la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel, o una de sus combinaciones. 35

48. Un método para blanquear una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, en condiciones de alta temperatura y pH alcalino, comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) proporcionar al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la 40 secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2;

(b) proporcionar una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel o una de sus combinaciones; y

(c) poner en contacto la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones; con el polipéptido de la etapa (a) en condiciones que 45 comprenden una temperatura d.

6. 85°C y pH 10, donde el polipéptido cataliza la hidrólisis de los compuestos en la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel, o una de sus combinaciones.

49. Un método para reducir el uso de agentes químicos de blanqueo en un procedimiento de blanqueo de 50 una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, en condiciones de alta temperatura y pH alcalino, comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) proporcionar al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; 55

(b) proporcionar una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel o una de sus combinaciones; y

(c) poner en contacto la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones; con el polipéptido de la etapa (a) en condiciones que comprenden una temperatura d.

6. 85°C y pH 10, 60

donde el polipéptido cataliza la hidrólisis de compuestos en la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, bioblanqueando de ese modo la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el

producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, y reduciendo el uso de agentes químicos de blanqueo en el procedimiento de blanqueo; o (d) el método de (c) , donde el agente de blanqueo químico comprende un cloro, un dióxido de cloro, un compuesto cáustico, un peróxido, o cualquiera de sus combinaciones.

50. Un método para liberar una lignina de una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, en condiciones de alta temperatura y pH alcalino, comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) proporcionar al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2; 10

(b) proporcionar una madera, producto de madera, pasta de madera, pasta Kraft, papel, producto de papel, pasta de papel que comprenden lignina, o una de sus combinaciones; y

(c) poner en contacto la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, de la etapa (b) con el polipéptido de la etapa (a) en condiciones que comprenden una temperatura d.

6. 85°C y pH 10, donde el polipéptido cataliza la hidrólisis de 15 compuestos en la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, facilitando de ese modo la liberación de lignina a partir de la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones; o (d) el método de (c) , donde el polipéptido cataliza la degradación de un enlace hemicelulosa de la lignina en la 20 madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, liberando de ese modo lignina.

51. Una composición que comprende:

una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, 25 una pasta de papel, o una de sus combinaciones y

un polipéptido de la reivindicación 14 o 15, o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

52. Un método para tratar una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un 30 papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, que comprende poner en contacto la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, con al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15, o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

53. Un método para blanquear una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, que comprende poner en contacto la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, con al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2. 40

54. Un método para reducir el uso de agentes químicos de blanqueo en un procedimiento de blanqueo de una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, que comprende:

poner en contacto la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de 45 papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, con al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

55. Un método para liberar una lignina de una madera, un producto de madera, una pasta de madera, una pasta Kraft, un papel, un producto de papel, una pasta de papel, o una de sus combinaciones, que comprende: 50

poner en contacto la madera, el producto de madera, la pasta de madera, la pasta Kraft, el papel, el producto de papel, la pasta de papel o una de sus combinaciones, con al menos un polipéptido de la reivindicación 14 o 15 o un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.