Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende

(a) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido,

en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de SEQ ID NO:275 en la longitud total de un ADNc, transcripto (ARNm) o gen, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa o codifica un polipéptido o péptido que actúa como un epítopo o inmunógeno y es capaz de generar un anticuerpo específico de aldolasa;

(b) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que se hidrida en condiciones rigurosas con el complemento de un ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO:275, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa o codifica un polipéptido o péptido que actúa como un epítopo o inmunógeno y es capaz de generar un anticuerpo específico de aldolasa;

(c) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO:276 o fragmentos enzimáticamente activos de la misma;

(d) el ácido nucleico de (a), (b) o (c) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa pero que carece de una secuencia señal,

(e) el ácido nucleico de (a), (b), (c) o (d) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa que comprende además una secuencia heteróloga; o

(f) una secuencia de ácidos nucleicos complementaria del ácido nucleico de (a), (b), (c), (d) o (e) .

Aldolasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para producir y usar las mismas Campo de acuerdo con la invención La presente invención se refiere a la biología molecular y celular y a la bioquímica. Más específicamente, la invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de aldolasa, polinucleótidos que codifican estos polipéptidos y métodos para preparar y utilizar polinucleótidos y polipéptidos.

Antecedentes de la invención

La monatina es un edulcorante de alta intensidad que tiene la fórmula química:

La monatina incluye dos centros quirales que conducen a cuatro posibles configuraciones estereoisoméricas. La configuración R, R (el "estereoisómero R, R" o "la monatina R, R") ; la configuración S, S (el "estereoisómero S, S" o "la monatina S, S") ; la configuración R, S (el "estereoisómero R, S" o "la monatina R, S") ; y la configuración S, R (el "estereoisómero S, R" o "la monatina S, R") . Tal como se utiliza en la presente, a menos que se indique de otra forma, el término "monatina" se usa para referirse a composiciones que incluyen los cuatro estereoisómeros de monatina, composiciones que incluyen cualquier combinación de estereoisómeros de monatina (tal como una composición que incluye solo los estereoisómeros R, R y S, S de monatina) , así como también una sola forma isomérica.

A los efectos de esta divulgación, la estructura principal de carbono se numerará como se ilustró anteriormente, siendo el carbono unido directa y covalentemente al grupo alcohol identificado como el carbono en la posición 2 y el carbono unido directa y covalentemente al grupo amino identificado como el carbono en la posición 4. Consecuentemente, las referencias en la presente una monatina R, R, monatina S, S, monatina R, S y monatina S, R significan: monatina 2R, 4R, monatina 2S, 4S, monatina 2R, 4S y monatina 2S, 4R, respectivamente, a menos que se indique de otra forma.

Cabe señalar que, en la bibliografía, la estructura principal de carbono de la monatina también se ha numerado usando una convención alternativa, siendo el carbono unido al grupo alcohol el carbono en la posición 4 y el carbono unido al grupo amino el carbono en la posición 2. Por lo tanto, por ejemplo, las referencias a la monatina 2S, 4R en esta divulgación serían iguales a las referencias a la monatina 2R, 4S en la bibliografía usando la convención de numeración alternativa.

Más aun, debido a las distintas convenciones de designación, la monatina se conoce con varios nombres químicos alternativos, entre los que se incluyen: ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-aminoglutárico; ácido 4-amino-2-hidroxi-2 (1H-indol-3-ilmetil) -pentanodioico; ácido 4-hidroxi-4- (3-indolilmetil) glutámico y 3- (1-amino-1, 3-dicarboxi-3-hidroxi-but4-il) indol.

Ciertas formas isoméricas de monatina pueden encontrarse en la corteza de las raíces de la planta Schlerochiton ilicifolius que se encuentra en la región de Transvaal en Sudáfrica. Las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 10/422.366 ("la solicitud '366") y 10/979.821 ("la solicitud '821") divulgan, entre otras cosas, polipéptidos, rutas y microorganismos para la producción in vitro e in vivo de monatina.

Resumen

La invención proporciona polipéptidos que tienen actividad de aldolasa (de aquí en adelante "aldolasas") , incluyendo actividad de piruvato aldolasa tal como, a modo no taxativo, actividad de HMG y KHG aldolasa, polinucleótidos que codifican los polipéptidos y métodos para preparar y utilizar los polipéptidos y polinucleótidos. En algunas realizaciones, la invención también proporciona composiciones que comprenden los polipéptidos de acuerdo con la invención. Estas composiciones pueden formularse en una variedad de formas, tales como comprimidos, geles, píldoras, implantes, líquidos, aerosoles, películas, micelas, polvos, alimento, granulados de pienso o cualquier tipo de forma encapsulada.

En algunas realizaciones, las aldolasas y/o composiciones de las mismas pueden ser útiles en contextos farmacéuticos, industriales y/o agrícolas.

En algunas realizaciones, las aldolasas y/o composiciones de las mismas pueden ser útiles para formar o escindir enlaces carbono-carbono.

En algunas realizaciones se proporcionan aldolasas que catalizan reacciones que forman enlaces carbono-carbono entre un aceptor de alfa-cetoácido y un piruvato o un donante derivado de piruvato (ver esquema de reacción más adelante) . En algunas realizaciones, el aceptor también puede ser una cetona o un aldehído. En algunas realizaciones se proporcionan aldolasas que tienen actividad 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (tal como 2-ceto-4hidroxiglutarato aldolasa, 2-oxo-4-hidroxiglutarato aldolasa, KHG-aldolasa, EC 4.1.3.16) y catalizan la siguiente reacción: 4-hidroxi-2-oxoglutarato <=> piruvato + glioxilato. En algunas realizaciones se proporcionan aldolasas que tienen actividad HMG-aldolasa (tal como 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolasa, piruvato aldolasa, aldolasa gamma-metil-gamma-hidroxi-alfa-cetoglutárica, 4-hidroxi-4-metil-2-cetoglutarato aldolasa, EC 4.1.3.17) y catalizan la siguiente reacción: 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato <=> 2-piruvato. Una HMG aldolasa también actuará sobre 4hidroxi-4-metil-2-oxoadipato y 4-carboxi-4-hidroxi-2-oxohexadioato.

Aldolasa R = H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, bencilo sustituido

R2 = H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, bencilo sustituido R3 = H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, bencilo, bencilo sustituido, ácido carboxílico.

En algunas realizaciones se proporcionan aldolasas, tales como una piruvato aldolasa, tal como, a modo no taxativo, una HMG y/o una KHG aldolasa, que facilitan la producción de un 2-ceto-glutarato 3, 4-sustituido. En una realización, la invención proporciona un método para preparar un 2-ceto-glutarato 3, 4-sustituido que comprende: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, tal como una actividad de piruvato aldolasa, tal como, a modo no taxativo, una actividad de HMG aldolasa y/o KMG aldolasa; (b) proporcionar un donante y un compuesto aceptor; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con los compuestos de la etapa (b) en condiciones en las cuales la aldolasa cataliza la síntesis de un 2-ceto-glutarato 3, 4-sustituido, en donde opcionalmente el donante y el aceptor son un piruvato o un donante de piruvato y un aceptor a-cetoácido, una cetona y/o un aldehído.

En algunas realizaciones se proporcionan aldolasas que facilitan la producción de ácido R-2-hidroxi 2- (indol-3ilmetil) -4-cetoglutárico (R-MP) , un precursor de monatina. En algunas realizaciones, una piruvato aldolasa, tal como una HMG y/o una KHG aldolasa, puede utilizarse junto con una D-aminotransferasa para preparar un ácido Dglutámico 4-sustituido o un derivado del mismo. Un ácido D-glutámico 4-sustituido y/o un derivado del mismo pueden utilizarse como un antibiótico, dado que se ha descubierto que estos compuestos inhiben la glutamato racemasa bacteriana (WO0214261A3) . En una realización, la invención proporciona un método para preparar un ácido Dglutámico 4-sustituido que comprende: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, tal como una actividad de piruvato aldolasa, tal como, a modo no taxativo, una actividad de HMG aldolasa y/o KMG aldolasa;

(b) proporcionar un aceptor a-cetoácido y un piruvato o un donante de piruvato; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con los compuestos de la etapa (b) en condiciones en las cuales la aldolasa cataliza la síntesis de un ácido D-glutámico 4-sustituido, en donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad de piruvato aldolasa, HMG aldolasa y/o KHG aldolasa y en donde opcionalmente el método además comprende el uso de una Daminotransferasa.

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o 100% (completa) de identidad de secuencia con respecto a un ácido nucleico de SEQ ID NO:275. En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos codifican al menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, incluyendo actividad de piruvato tal como, a modo no taxativo, actividad de HMG y/o KHG aldolasa. En algunas realizaciones, las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende

(a) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de SEQ ID NO:275 en la longitud total de un ADNc, transcripto (ARNm) o gen,

en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa o codifica un polipéptido o péptido que actúa como un epítopo o inmunógeno y es capaz de generar un anticuerpo específico de aldolasa;

(b) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que se hidrida en condiciones rigurosas con el complemento de un ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO:275, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa o codifica un polipéptido o péptido que actúa como un epítopo o inmunógeno y es capaz de generar un anticuerpo específico de aldolasa;

(c) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO:276 o fragmentos enzimáticamente activos de la misma;

(d) el ácido nucleico de (a) , (b) o (c) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa pero que carece de una secuencia señal,

(e) el ácido nucleico de (a) , (b) , (c) o (d) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa que comprende además una secuencia heteróloga; o

(f) una secuencia de ácidos nucleicos complementaria del ácido nucleico de (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

2. Un par de cebadores de amplificación, en donde el par de cebadores de amplificación

(a) es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprende una secuencia de la reivindicación 1 o una subsecuencia de la misma, o

(b) es el par de cebadores de (a) , en donde un miembro del par de cebadores comprende un oligonucleótido que comprende al menos 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia de la reivindicación 1 o 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o más bases consecutivas de la secuencia o

(c) es el par de cebadores de (b) , que comprende un primer miembro que tiene una secuencia de los primeros (5') 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o más residuos de una secuencia de la reivindicación 1, y un segundo miembro que tiene una secuencia de los primeros (5') 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o más residuos de la hebra complementaria del primer miembro.

3. Un cassette de expresión, vector o vehículo de clonación que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1.

4. Una célula transformada que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1 o que comprende un cassette de expresión, vector o vehículo de clonación de la reivindicación 3.

5. Un animal no humano, planta, parte de planta o semilla transgénicos que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1 o que comprende un cassette de expresión, vector o vehículo de clonación de la reivindicación 3 o una célula transformada como se establece en la reivindicación 4.

6. Un polipéptido o péptido aislado, sintético o recombinante que tiene una actividad de aldolasa que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más o 100% de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO:276 en la longitud total del polipéptido o enzima, y/o fragmentos enzimáticamente activos de la misma;

(b) una secuencia de aminoácidos codificada mediante un ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene

(i) una actividad de aldolasa o

(ii) tiene actividad inmunogénica ya que es capaz de generar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia de (a) , y/o fragmentos enzimáticamente activos de la misma;

(c) el polipéptido de (a) o (b) que tiene una actividad de aldolasa pero que carece de una secuencia señal;

(d) el polipéptido de (a) , (b) o (c) que tiene una actividad de aldolasa y que comprende además una secuencia heteróloga; o

(e) el polipéptido de (a) , (b) , (c) o (d) , en donde el polipéptido comprende al menos un sitio de glicosilación.

7. Un anticuerpo aislado, sintético o recombinante que se une específicamente a un polipéptido de la reivindicación

6.

8. Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un ácido nucleico de la reivindicación 1; y

(b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, produciendo así un polipéptido recombinante.

9. Un método para generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de aldolasa que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un ácido nucleico plantilla que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1; y

(b) modificar, eliminar o agregar uno o más nucleótidos en la secuencia plantilla o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico plantilla.

10. El método de la reivindicación 9, que es un método para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido de aldolasa, comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) proporcionar un ácido nucleico de la reivindicación 1; y

(b) identificar un codón en el ácido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo por un codón diferente que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, modificando así codones en un ácido nucleico que codifica una aldolasa.

11. Una secuencia señal o líder aislada, sintética o recombinante que consiste en una secuencia de aminoácidos como se establece en los residuos amino terminales 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, I1a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43 o 1 a 44, de una secuencia de aminoácidos de la reivindicación 6.

12. Un método para escindir un enlace carbono-carbono en una composición que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1;

(b) proporcionar una composición que comprende un enlace carbono-carbono; y

(c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que la aldolasa escinde el enlace carbono-carbono en la composición.

13. Un método para formar un enlace carbono-carbono que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1;

(b) proporcionar un donante y un compuesto aceptor; y

(c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con los compuestos de la etapa (b) en condiciones en las que la aldolasa forma el enlace carbono-carbono.

14. El método de la reivindicación 13 que es un método para obtener un ácido D-glutámico 4-sustituido que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1;

(b) proporcionar un aceptor de a-cetoácido y un piruvato o un donante de piruvato; y

(c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con los compuestos de la etapa (b) en condiciones en las que la aldolasa cataliza la síntesis de un ácido D-glutámico 4-sustituido.

15. El método de la reivindicación 13 que es un método para obtener un 2-ceto-glutarato 3, 4-sustituido que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1;

(b) proporcionar un donante y un compuesto aceptor, en donde opcionalmente el donante y el aceptor son un piruvato o un donante de piruvato y un aceptor de a-cetoácido, una cetona y/o un aldehído; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con los compuestos de la etapa (b) en condiciones en las 10 que la aldolasa cataliza la síntesis de un 2-ceto-glutarato 3, 4-sustituido.

16. Una composición que comprende un polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1.

17. Un método para obtener un alimento, pienso o bebida que comprende poner en contacto una composición que comprende un compuesto que contiene un enlace carbono-carbono con un polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1.

18. Un método para la conversión de una biomasa o cualquier material lignocelulósico en un combustible que comprende poner en contacto la biomasa o material lignocelulósico con un polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1 o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.