Sonda de actividad de la tirosina-cinasa de Bruton y procedimiento de utilización.

Sonda de actividad de la Btk que comprende un resto inhibidor de la Btk que se une covalentemente a un residuode cisteína de una enzima Btk,

un fluoróforo y un resto conector que une el resto inhibidor al fluoróforo, en la que elresto inhibidor es el siguiente: **Fórmula**

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/023306.

Solicitante: PHARMACYCLICS, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 995 E. Arques Avenue Sunnyvale, CA 94085 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: Pan,Zhengying, LI,SHYR JIANN, SCHEREENS,HELEEN, Honigberg,Lee, Verner,Erik.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07D487/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07D COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares C08). › Compuestos heterocíclicos que contienen átomos de nitrógeno como únicos heteroátomos del ciclo en el sistema condensado, no previstos por los grupos C07D 451/00 - C07D 477/00.
  • C07D487/04 C07D […] › C07D 487/00 Compuestos heterocíclicos que contienen átomos de nitrógeno como únicos heteroátomos del ciclo en el sistema condensado, no previstos por los grupos C07D 451/00 - C07D 477/00. › Sistemas condensados en orto.
  • G01N33/573 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para enzimas o isoenzimas.

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Fragmento de la descripción:

Sonda de actividad de la tirosina-cinasa de Bruton y procedimiento de utilización.

Campo de la invención En la presente memoria se describen sondas para la tirosina-cinasa de Bruton (Btk) y la utilización de dichas sondas para medir la actividad de la Btk, para evaluar la actividad de los moduladores de la Btk y para evaluar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de dichos moduladores.

Antecedentes La tirosina-cinasa de Bruton (Btk) , un miembro de la familia Tec de las tirosina-cinasas no receptoras, tiene un papel esencial en la vía de señalización de los linfocitos B que enlaza la estimulación del receptor de superficie de los linfocitos B (BCR) con las respuestas intracelulares posteriores. Resulta necesaria para el desarrollo y el funcionamiento normales de los linfocitos B en humanos y ratones, tal como ponen de manifiesto las mutaciones en el gen de la Btk que dan lugar al fenotipo de agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA) en humanos y a un fenotipo de inmunodeficiencia ligada al cromosoma X (xid) en ratones. Véase, por ejemplo, D. A. Fruman y otros, (2000) , Immunity 13:1-3. La Btk se expresa en todos los tipos de células hematopoyéticas, excepto en los linfocitos T y en los linfocitos citolíticos naturales, y participa en una serie de vías de señalización de receptores TLR y de citocinas, incluida la producción de TNF-a inducida por lipopolisacáridos (LPS) en los macrófagos, lo que sugiere la existencia de una función general de la Btk en la regulación inmunitaria.

La Btk contiene un dominio de homología a plecstrina (PH) aminoterminal seguido por un dominio de homología a Tec (TH) , dominios reguladores de homología a Src (SH3, SH2) y un dominio de cinasa carboxiterminal (SH1) . En los linfocitos B no estimulados, la Btk se localiza en el citoplasma, donde es catalíticamente inactiva, presumiblemente debido a una conformación terciaria derivada de las interacciones intramoleculares entre el dominio de cinasa y los dominios SH2 y/o SH3, que bloquean el acceso de los sustratos al sitio activo. Tras la estimulación del BCR, la Btk se recluta en la membrana celular a través de interacciones entre el dominio PH aminoterminal y los fosfoinosítidos de la membrana celular. A continuación, la Btk asociada a la membrana es fosforilada en la Tyr 551 en el bucle de activación por parte de las cinasas de la familia Src. La posterior autofosforilación en Tyr 223 de la Btk estabiliza la conformación activa y activa completamente la actividad de la cinasa Btk. La Btk activada fosforila la fosfolipasa (PLCy) , dando inicio a la movilización del calcio y generando diacilglicerol (DAG) como señales secundarias, lo que finalmente conduce a la activación transcripcional y la amplificación de la estimulación del BCR.

El documento WO 2006/053121 da a conocer imidazo[1, 2-a]pirazin-8-ilaminas y compuestos relacionados, composiciones que comprenden dichos compuestos y procedimientos de utilización de las mismas. El documento WO 2006/0529131 da a conocer pirazolo[1, 5-a]pirimidinas útiles como inhibidores de proteína-cinasas. El documento WO 2007/041712 da a conocer una clase de compuestos aminosustituidos de pirazolo[1, 5-a]pirimidina como inhibidores de cinasas de proteínas y/o puntos de regulación. El documento WO 03/081210 describe la identificación de inhibidores de las proteína-cinasas que se unen preferentemente a la conformación inactiva de una proteína-cinasa diana. El documento WO 2008/039218 se refiere a compuestos que forman enlaces covalentes con la tirosina-cinasa de Bruton. En Nam N-H y otros, Bioorganic & Medicinal Chemistr y , pergamon, GB, vol. 12, nº. 22, 15 de noviembre de 2004, páginas 5.753-5.766, se describen conjugados ATP-fosfopéptido como inhibidores de las tirosina-cinasas de tipo Src.

Características de la invención La presente invención se refiere a sondas de actividad de la tirosina-cinasa de Bruton (Btk) tal como se definen en las reivindicaciones. Además, se describen sondas de actividad de la Btk tal como se definen en las reivindicaciones, que incluyen un inhibidor irreversible de la Btk, un resto conector y un resto indicador. Además, se describen sondas de actividad de la Btk tal como se definen en las reivindicaciones, que incluyen un resto aceptor de adición de Michael en la estructura de la sonda de actividad. Además, se describen sondas de actividad de la Btk tal como se definen en las reivindicaciones, que forman un enlace covalente con un residuo de cisteína de la Btk. Además, en la presente memoria se describen sondas de actividad que forman un enlace no covalente con un residuo de cisteína de la Btk. Además, en la presente memoria se describen sondas de actividad de otras tirosinacinasas, en las que las otras tirosina-cinasas presentan homología con la Btk, o son sustancialmente idénticas a la misma, por tener un residuo de cisteína (incluido un residuo Cys 481) que forma un enlace covalente o no covalente con la sonda de actividad. También se describen en la presente memoria procedimientos para la síntesis de dichas sondas de actividad, procedimientos para la utilización de dichas sondas de actividad en el estudio de la actividad de la Btk y otras tirosina-cinasas que presentan un residuo Cys 481, procedimientos para la utilización de dichas sondas de actividad en el estudio de inhibidores de la Btk y otras tirosina-cinasas que presentan un residuo Cys 481, y procedimientos para la utilización de dichas sondas de actividad en el estudio de las propiedades farmacodinámicas de inhibidores de la Btk y otras tirosina-cinasas que presentan un residuo Cys 481.

En un aspecto, la presente invención da a conocer una sonda de actividad de la Btk que comprende un resto inhibidor de la Btk, tal como se define en las reivindicaciones, un resto indicador y un resto conector que une el resto inhibidor al resto indicador.

Una forma de realización consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el resto conector enlaza covalentemente el resto inhibidor al resto indicador. Otro ejemplo consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el resto inhibidor de la Btk modifica un residuo de cisteína de una enzima Btk. Otra forma de realización consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el resto inhibidor de la Btk modifica covalentemente el residuo de cisteína de la enzima Btk. Aún otra forma de realización consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el residuo de cisteína se encuentra en el bolsillo de unión a ATP de la enzima Btk. Aún otra forma de realización consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el residuo de cisteína es la Cys 481 de la enzima Btk. Una forma de realización consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el resto conector se selecciona entre un enlace, un resto alquilo opcionalmente sustituido, un resto heterociclo opcionalmente sustituido, un resto amida opcionalmente sustituido, un resto cetona, un resto carbamato opcionalmente sustituido, un resto éster o una combinación de los mismos. Otra forma de realización consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el resto conector comprende un resto heterociclo opcionalmente sustituido. Otra forma de realización consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el resto heterociclo opcionalmente sustituido comprende un resto basado en piperazinilo.

También se describe en la presente memoria una sonda de actividad de la Btk en la que el resto indicador se selecciona entre el grupo formado por un marcador, un colorante, un fotorreticulador, un compuesto citotóxico, un fármaco, un marcador de afinidad, un marcador de fotoafinidad, un compuesto reactivo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un biomaterial, una nanopartícula, un marcador de espín, un fluoróforo, un resto que contiene un metal, un resto radiactivo, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactúa de forma covalente o no covalente con otras moléculas, un resto que contiene una jaula fotoactivable, un resto excitable por radiación actínica, un ligando, un resto fotoisomerizable, biotina, un análogo de la biotina, un resto que presenta un átomo pesado, un grupo químicamente escindible, un grupo fotoescindible, un agente con actividad redox, un resto marcado isotópicamente, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo con alta densidad electrónica, un grupo magnético, un grupo intercalante, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, un marcador detectable o una combinación de los mismos. En la presente forma de realización, está prevista una sonda de actividad de la Btk en la que el resto indicador es un fluoróforo. Aún otra forma de realización consiste en una sonda de actividad de la Btk en la que el fluoróforo es un fluoróforo... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Sonda de actividad de la Btk que comprende un resto inhibidor de la Btk que se une covalentemente a un residuo de cisteína de una enzima Btk, un fluoróforo y un resto conector que une el resto inhibidor al fluoróforo, en la que el resto inhibidor es el siguiente:

2. Sonda de actividad de la Btk según la reivindicación 1, en la que el fluoróforo es un fluoróforo Bodipy. 10

3. Sonda de actividad de la Btk según la reivindicación 1 o 2, en la que el resto conector se selecciona entre un enlace, un resto alquilo opcionalmente sustituido, un resto heterociclo opcionalmente sustituido, un resto amida opcionalmente sustituido, un resto cetona, un resto carbamato opcionalmente sustituido, un resto éster o una combinación de los mismos, opcionalmente en la que el resto conector comprende un resto heterociclo opcionalmente sustituido, opcionalmente en la que el resto heterociclo opcionalmente sustituido comprende un resto piperazinilo opcionalmente sustituido.

4. Sonda de actividad de la Btk según la reivindicación 2 de la estructura siguiente:

5. Sonda de actividad de la Btk según la reivindicación 2 de la estructura siguiente:

Núcleo Conector Bodipy 530

6. Sonda de actividad de la Btk según la reivindicación 1, para su utilización en la evaluación de la eficacia o las propiedades farmacodinámicas de un inhibidor de la Btk en un mamífero.

7. Sonda de actividad de la Btk para su utilización según la reivindicación 6, para evaluar la eficacia de un inhibidor potencial de la Btk en un mamífero mediante la administración de la sonda de actividad de la Btk al mamífero, medir la actividad de la sonda de actividad de la Btk en el mamífero o en células aisladas del mismo y comparar la actividad del resto indicador con un patrón.

8. Sonda de actividad de la Btk para su utilización según la reivindicación 6, para evaluar las propiedades farmacodinámicas de un inhibidor de la Btk en un mamífero mediante la administración de un inhibidor de la Btk a una pluralidad de mamíferos y medir la actividad de la sonda de actividad de la Btk en diferentes instantes tras la administración del inhibidor en el mamífero o en células aisladas del mismo.

9. Procedimiento para marcar o detectar una enzima Btk in vitro, comprendiendo dicho procedimiento de marcado la puesta en contacto de células o tejidos que expresan la enzima Btk con una sonda de actividad de la Btk según la reivindicación 1, o comprendiendo dicho procedimiento de detección la separación de las proteínas marcadas por una sonda de actividad de la Btk según la reivindicación 1 por electroforesis y la detección de la sonda de actividad de la Btk por fluorescencia.


 

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