Reguladores implicados en la formación de setas.

Hongo o seta con un nivel de expresión aumentado de un polipéptido implicado en la formación de seta,

donde elpolipéptido tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56 y/o tiene al menos un 50 % de identidadde aminoácido con SEC ID n.º: 202, y donde el nivel de expresión aumentado del polipéptido es una producción aumentadadel polipéptido y/o una actividad más alta de dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor del que deriva este hongo/setacuando ambos son evaluados y/o son cultivados bajo las mismas condiciones

Reguladores implicados en la formación de setas Campo de la invención [0001] La invención se refiere a una seta y a un método para producir dicha seta donde la seta tiene un nivel de expresión aumentado de un polipéptido y/o un nivel de expresión disminuido de un polipéptido, donde el polipéptido se codifica por una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene al menos un 40 % de identidad con SEC ID n.º: 56 y/o que tiene al menos un 50 % identidad con SEC ID n.º : 202.

Antecedentes de la invención [0002] La formación de setas es un proceso de desarrollo altamente complejo. Como un ejemplo, describimos un esquema generalizado para la formación de cuerpos frutales agáricos tales como los de Agaricus bisporus (véase Kües, 2000; Umar and van Griensven, 1997) . Después de que una "masa crítica" de micelio sumergido se haya formado, las hifas escapan del sustrato para crecer en el aire. Estas hifas forman agregados, que son llamados nudos hifales o nódulos. En los nudos las hifas se agregan formando un cuerpo frutal inicial. En el núcleo del inicial la diferenciación de células ocurre. La parte inferior se desarrollará en el estipe, mientras que la cobertura será formada a partir de la parte superior. En la cobertura se desarrollan diferentes tejidos. En la parte interna de la cobertura se pueden distinguir la trama de píleo y branquias con un himenio. En el himenio diferentes tipos de célula son formados, entre los cuales la basidia. En el basidio tienen lugar la cariogamia y la meiosis, en última instancia dando como resultado basidioesporas. Este desarrollo de cuerpos frutales es complejo está también ejemplificado en el hecho de que la formación de los tejidos diferentes se superpone en el tiempo. Por otra parte, las células en la seta en desarrollo difieren en diámetro, longitud, número de tabiques, núcleos y vacuolas al igual que en la composición molecular (p. ej. el contenido de reserva de carbohidrato) .

Las esporas formadas por A. bisporus contienen dos núcleos con un tipo de acoplamiento diferente. La germinación de estas esporas así produce un micelio heterocariótico autofértil, con un número variable de ambos tipos nucleares. En cambio, la fase fértil de una mayoría de hongos que forman setas resultan de un acoplamiento de dos cepas compatibles con diferentes loci de tipo acoplamiento. Durante el acoplamiento, los socios intercambian núcleos. Estos núcleos no se fusionan sino que se mantienen en el compartimento hifal. Tales micelios son por lo tanto llamados heterocarióticos (en el caso de que cada compartimento contenga un núcleo de cada tipo se llama un dicarión) . Estos pueden formar cuerpos frutales bajo las condiciones nutricionales y medioambientales apropiadas. Los loci tipo acoplamiento son los reguladores maestros del desarrollo del cuerpo frutal. Se conoce poco acerca del sistema tipo acoplamiento de A. bisporus. Se supone que este hongo contiene un único locus tipo acoplamiento. Los loci tipo acoplamiento de Schizofillum commune y Coprinus cinereus y su papel en el desarrollo han sido estudiados bien (para una revisión véase Kües, 2000) . Tanto S. commune como C. cinereus contienen dos loci tipo acoplamiento. El locus A codifica proteínas homeodominio. Estas proteínas funcionan por formación de heterodímeros con proteínas de homeodominio codificadas en un locus A compatible. Algunas de estas proteínas de homeodominio también parecen formar homodímeros funcionales. El locus B codifica feromonas y receptores. Estos receptores pueden enlazar feromonas codificadas por otros alelos del locus B. Tanto el locus A como el B regulan procesos celulares diferentes implicados en el establecimiento del micelio dicariótico. No obstante, ellos regulan de manera coordinada la iniciación del cuerpo frutal. Claramente, la presencia de loci de tipo de acoplamiento A y B compatibles no es suficiente para originar fruta. Por ejemplo, en C. Cinereus en los agregados formados por un dicarión pueden desarrollar en una fruta inicial o en esclerocio. Condiciones medioambientales tales como luz y disponibilidad de nutriente determinarán qué programa de desarrollo será accionado.

Se conoce poco acerca de proteínas reguladoras diferentes de aquellas codificadas por los loci tipo acoplamiento que están implicadas en la formación de setas en general y en la iniciación de fruta en particular. A diferencia de A. bisporus, al menos algunos mutantes y genes han sido identificados en S. commune y C. cinereus. La mutación fbf es una mutación recesiva frecuentemente observada en S. commune que suprime procesos específicos de dicarión en hifas vegetativas al igual que la formación de cuerpos de fruta (Springer and Wessels, 1989) . El gen FBF así parece ser un activador. Por otro lado, el gen FRT de S.commune suprime la expresión de genes específicos de dicarión en monocariones (Horton et al., 1999) . Otras cepas mutantes afectadas en el desarrollo del cuerpo de fruta en S. commune han sido descritas pero los genes implicados no han sido identificados. Estos mutantes están afectados en la morfología del cuerpo frutal o su esporulación (Raper and Krongelb, 1958; Bromberg and Schwalb, 1977) . Recientemente, diferentes genes implicados en la formación del cuerpo de fruta han sido identificados en C.cinereus. El gen pcc1 funciona en el desarrollo regulado de A y codifica una proteína de enlace de ADN putativa (Murata et al., 1998) . Una mutación en el gen resultó en un programa completo de diferenciación sexual independiente de los genes tipo acoplamiento. La función de pcc1 es, no obstante, desconocida. Los genes ich1 y eln2 están implicados en la diferenciación del primordio (Muraguchi et al., 1998, 2000) . Mutaciones en estos genes afectan la formación del píleo y del estipe, respectivamente. Claramente, estos datos no presentan una imagen de cómo se regula la formación del cuerpo frutal a nivel molecular.

Hasta el momento, genes implicados en la regulación/iniciación de la producción de setas no han sido descritos. Estos genes controlan la formación de setas y son por lo tanto objetivos para mejorar la producción de setas, para mejorar la calidad de las setas, para aumentar previsibilidad de la producción de setas y para permitir la producción de setas en sustratos sobre los que ellas todavía no pueden ser producidas eficazmente.

Descripción de la invención [0006] Hemos estudiado la expresión de factores de transcripción putativos en el sistema modelo de formación de hongos Schizophyllum commune. S. commune se puede encontrar en todo el mundo. Es un basidiomiceto de madera que se está pudriendo que forma cuerpos frutales en madera dura talada pero puede encontrarse también en la madera de coníferas y ensilaje de césped. Los basidios que se forman en las branquias están dispersos y pueden dar lugar a un micelio monocariótico. La fusión de monocariones con alelos diferentes en los loci de tipo acomplamiento MATA y MATB produce un dicarión fértil que puede formar cuerpos frutales bajo las condiciones medioambientales apropiadas. S. commune puede formar cuerpos frutales esporulantes en medios sintéticos simples en plazo de unos días. Esto y el hecho de que monocariones están disponibles fue la razón de que S. commune se volviera un sistema modelo para basidiomicetos frutales. Tanto la genética molecular como la tradicional han sido establecidas en S. commune. Nosotros estamos seguros de que programas reguladores en S. commune, A. bisporus y otros basidiomicetos están bastante conservados. Hemos mostrado que los promotores de los genes sc3 y gpd de S. commune están activos en el basidiomiceto no relacionado Pycnoporus cinnabarinus (Alves et al., 2004) .

Genes implicados en la sincronización de la formación de setas y en la morfología y rendimiento son objetivos para mejorar (es decir, para setas que actualmente son producidas comercialmente, incluyendo pero no limitado a la seta de botón blanco común [el "champiñón"], la seta de ostra y shiitake) o para permitir (es decir, para setas que no son actualmente producidas en una disposición comercial) la formación de setas comerciales. Hemos identificado 200 genes en el genoma de S. commune que codifican reguladores putativos cuya expresión cambia durante la formación de seta. Estos genes podrían estar implicados en la formación de setas. Hemos encontrado que la inactivación de ocho de estos genes afectó a la producción de setas. La producción fue bien promovida o bien disminuida, si estaba en absoluto presente. Homólogos de estos genes reguladores putativos se pueden encontrar en otros hongos que forman setas. En la presente invención como se describe además aquí, haremos uso de los genes que codifican reguladores transcripcionales putativos y cuyo cambio de expresión durante la formación... [Seguir leyendo]

1. Hongo o seta con un nivel de expresión aumentado de un polipéptido implicado en la formación de seta, donde el polipéptido tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56 y/o tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 202, y donde el nivel de expresión aumentado del polipéptido es una producción aumentada del polipéptido y/o una actividad más alta de dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor del que deriva este hongo/seta cuando ambos son evaluados y/o son cultivados bajo las mismas condiciones.

2. Hongo o seta según la reivindicación 1, que comprende además un nivel aumentado o disminuido de expresión de un polipéptido, donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es aumentado o disminuido tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con una secuencia seleccionada de SEC ID nº: 1-55.

5. 200 y/o que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con una secuencia seleccionada de SEC ID nº: 201.

20. 208.

3. Hongo o seta según la reivindicación 1, donde el polipéptido del cual el nivel de expresión es aumentado es un polipéptido heterólogo.

4. Hongo o seta según la reivindicación 1, donde el polipéptido del cual el nivel de expresión es aumentado es un polipéptido endógeno.

5. Hongo o seta según la reivindicación 2, donde el nivel de expresión disminuido se alcanza por una producción disminuida del polipéptido y/o una actividad inferior de dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor del que deriva este hongo/seta cuando ambos son evaluados y/o cultivados bajo las mismas condiciones.

6. Hongo o seta según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5, donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es aumentado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56 y donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es disminuido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con una secuencia seleccionada de SEC ID n.º: 55, 21, 54.

7. Hongo o seta según la reivindicación 6, donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es aumentado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 202 y donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es disminuido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 206, 205 y 203.

8. Hongo o seta según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el hongo/seta es un Ascomiceto o un Basidiomiceto, preferiblemente un Basidiomiceto, preferiblemente un Agaricales.

9. Método para la producción de las setas tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Método para producir una sustancia de interés que utiliza una seta tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos:

(a) que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56; y/o,

(b) que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 202;

donde la secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en un hongo o una seta.

12. Método para identificación de un estímulo capaz de influir en la producción de una seta, el método que incluye las etapas de:

(a) proporcionar un hongo o una seta;

(b) aplicar dicho estímulo a dicho hongo/seta;

(c) determinar el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos o la actividad o nivel estable de un polipéptido codificado correspondiente en el hongo/seta del paso b) donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56 y/o que tiene al menos un 50 % de identidad de

aminoácido con SEC ID n.º: 202,

(d) comparar la expresión, actividad o nivel estable determinado en (c) con la expresión, actividad o nivel estable de la

secuencia de nucleótidos o del polipéptido en un hongo/seta al que no se ha proporcionado dicho estímulo; y, 5

(e) identificar un estímulo que produce una diferencia en el nivel de expresión, actividad o nivel estable de dicha secuencia de nucleótidos o polipéptido, entre el hongo/seta que ha sido provisto de dicho estímulo y el hongo/seta al que no se ha proporcionado dicho estímulo 13. Método según la reivindicación 12, por el cual los niveles de expresión, actividades o niveles estables superiores a una secuencia de nucleótidos o más de unos polipéptidos son comparados.