Una nueva proteína, un gen que la codifica, y un método para su uso.

Una proteína que muestra una actividad de unión a biotina, en donde dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:

4, o una secuencia de aminoácidos con 80% o más de homología con dichas secuencias.

Una nueva proteina, un gen que la codifica, y un metodo para su uso

Campo de la invención La presente invención se refiere a una nueva proteína que tiene una actividad antifúngica y un método para la producción de la misma, un gen que codifica la proteína, y un método de uso de la proteína y el gen. Específicamente, se refiere a una proteína originada de Pleurotus cornucopiae que tiene una actividad antifúngica contra al menos el añublo del arroz (Magnaporthe grisea) , un gen que codifica la proteína, y un método de uso de la proteína y el gen.

La presente solicitud reivindica la prioridad basada en la Solicitud de Patente Japonesa No. 2001-68894 presentada el 12 de Marzo, 2001.

Técnica anterior

Enzimas líticas tales como la quitinasa y la β-1, 3-glucanasa son conocidas como proteínas vegetales que tiene una actividad antifúngica contra microorganismos patógenos de plantas. Los experimentos in vitro han demostrado que estas enzimas pueden ejercer el efecto si se emplean solas (Schlumbaum et al. (1986) , Nature 324, págs. 365-367) , pero se puede obtener un efecto general mejorado si se utiliza una combinación de dos o más de tales enzimas (Mauch et al. (1988) , Plant Physiol. 88, págs. 936-942) . Se sabe que la concentración de inhibición del crecimiento de estas enzimas líticas contra hongos filamentosos debe ser típicamente de aproximadamente varias decenas a varios cientos de μg/ml cuando se usan solas, o aproximadamente varios μg/ml por enzima cuando se usan combinadas. Sin embargo, se ha informado que ninguna de estas enzimas líticas tiene un efecto antifúngico contra el añublo del arroz (Magnaporthe grisea) , que causa grandes daños a los cultivos de arroz.

Péptidos antifúngicos (AFP) de bajo peso molecular, tales como la defensina también tienen una actividad antimicrobiana. Entre ellos, se ha informado que Ca-AMP1 (Publicación Doméstica Japonesa Núm. 505048/96) , CB1 (Oita et al. (1996) , Biosci. Biotech. Biochem. 60, págs. 481-483) , Rs-AFP1 y Rs-AFP2 (Terras et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, págs. 15301-15309) y Ace-AMP1 (Declaración Interna Japonesa Núm. 501424/97) tienen un efecto antifúngico contra el añublo del arroz. Estos péptidos de bajo peso molecular inhiben 50% del crecimiento de diversos microorganismos patógenos de plantas, incluyendo el mencionado anteriormente a una concentración en el orden de varios μg/ml.

También se han realizado intentos de crear una planta resistente a enfermedades aislando el gen para una enzima lítica o un péptido antifúngico de bajo peso molecular y transfectándolo a una planta (Broglie et al. (1991) , Science 254, págs.1194-1197; Terras et al. (1995) , The Plant Cell 7, págs. 573-588) . Un estudio reciente sobre el arroz informó que el arroz transformante obtenido mediante expresión en exceso de quitinasa derivada de arroz ejerció un aumento de la resistencia al añublo del arroz (Nishizawa et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 99:383-390) .

También se ha informado sobre otras plantas resistentes a microorganismos patógenos creadas mediante introducción de genes como para la proteína PR (Alexander et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: págs.73277331) , glucosa oxidasa (Wu et al. (1995) Plant Cell 7: págs.1357-1368) , estilbeno sintasa (Hain et al. (1993) Nature 361: págs.153-156) , etc.

Sin embargo, muchos casos existentes no consiguen obtener plantas transgénicas que tienen resistencia prácticamente aceptable. Esto puede atribuirse al bajo nivel de expresión de los transgenes, y más esencialmente la baja actividad antifúngica de las proteínas antifúngicas notificado hasta la fecha. Por lo tanto, sería deseable identificar y aplicar prácticamente una proteína antifúngica más potente que las convencionales.

Descripción de la invención Un objeto de la presente invención es buscar e identificar una nueva proteína antifúngica capaz de inhibir el crecimiento de diversos microorganismos patógenos de plantas, incluyendo añublo del arroz (Magnaporthe grisea) , que causa grandes daños a los cultivos de arroz.

Otro objeto de la presente invención es clonar un gen que codifica dicha nueva proteína, y determinar la secuencia de nucleótidos del mismo.

Otro objeto más de la presente invención es introducir el gen de la presente invención en un organismo anfitrión (microorganismo, animal, planta, etc.) para crear un transformante, y de este modo aplicar en la práctica el gen de la presente invención.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un agente antifúngico que contiene la proteína antifúngica de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos La FIG. 1 muestra la apariencia de la inhibición del crecimiento de M. grisea por la proteína antifúngica de la presente invención (cultivos de 48 horas en la presencia de una fracción de proteína calentada a 80°C durante 10 minutos) . La FIG. 2 muestra los patrones electroforéticos de fracciones de proteína de Pleurotus cornucopiae separadas por una columna de Q-Sepharose FF con respecto a una actividad antifúngica. M representa un marcador de peso molecular, y FT representa la fracción que ha pasado a través de la columna. Los símbolos (-, +, ++) por debajo de las calles indican la fuerza de la actividad antifúngica. Las actividades antifúngicas mostradas entre paréntesis pertenecen a fracciones distintas de las purificadas descritos en la presente invención. La FIG. 3 muestra un diagrama de separación de la proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae mediante columna MonoQ con respecto a una actividad antifúngica. Las posiciones de elución que muestran la actividad antifúngica se indican mediante +. La FIG. 4 muestra patrones electroforéticos de proteína de Pleurotus cornucopiae separada mediante una columna Mono Q con respecto a una actividad antifúngica. Los números por encima de las calles corresponden a los números de fracción en la FIG. 3, M representa un marcador de peso molecular, y Ori representa la fracción de Q-Sepharose aplicada en Mono Q. Los símbolos (-, +, ++, +++) por debajo de las calles indican la fuerza de una actividad antifúngica. Las flechas indican la proteína antifúngica (15 kDa) . La FIG. 5 muestra un diagrama de separación de la proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae mediante Superose 6 con respecto a una actividad antifúngica. Las flechas indican las posiciones de elución del patrón de filtración en Gel (BIO-RAD) . Las posiciones de las fracciones que muestran la actividad antifúngica se indican mediante +. La FIG. 6 muestra patrones electroforéticos de proteína de Pleurotus cornucopiae purificada mediante Superose 6 con respecto a una actividad antifúngica. Los números por encima de las calles corresponden a los números de fracción en la Fig. 5, Ori representa la fracción MonoQ aplicada en Superose 6 y M representa un marcador de peso molecular. Los símbolos (-, +, ++) por debajo de las calles indican la fuerza de una actividad antifúngica. La flecha indica la proteína antifúngica (15 kDa) . La FIG. 7 muestra un árbol taxonómico molecular de las secuencias de aminoácidos (regiones de proteína maduras) de tamavidina 1 (no de acuerdo con la presente invención) y tamavidina 2, estreptavidina y su homólogo, y avidina. La FIG. 8 muestra los resultados de experimentos de supresión de una actividad antifúngica mediante adición de biotina. Las esporas de M. grisea suspendidas en 1/2 PD se colocaron en placas de microtitulación. Los pocillos que contenían 1000 ng/ml de tamavidina 1 purificada (no de acuerdo con la presente invención) , estreptavidina y avidina, o pocillos que contenían 100 ng/ml de biotina además de estas proteínas a las mismas concentraciones, o pocillos que no contenían proteína se prepararon y se incubaron a 28°C durante 48 horas. También se muestran los pocillos que contenían 50 ng/ml de tamavidina 1 purificada (no de acuerdo con la invención) . La FIG. 9 muestra la purificación de tamavidina 2 recombinante expresada en E. coli en una columna de iminobiotina. C representa la fracción de proteína soluble total de E. coli, que no se indujo mediante IPTG, y T representa la fracción de proteína soluble total de E. coli inducida por IPTG 1 mM. F representa la fracción de proteína que ha pasado a través de la columna de iminobiotina sin unirse a la columna, obtenida a partir de la fracción de proteína soluble total de E. coli inducida por IPTG 1 mM, W representa la fracción eluida lavando la columna, y E representa la fracción eluida con un tampón ácido. Las flechas indican la proteína tamavidina 2 (aproximadamente 15 kDa) , y M representa un marcador de peso molecular (Kit de marcaje LMW: Pharmacia LKB) .

Descripción detallada de la invención Con el... [Seguir leyendo]

1. Una proteína que muestra una actividad de unión a biotina, en donde dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos con 80% o más de homología con dichas secuencias.

2. La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos con 90% o más de homología con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4.

3. La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos con 95% o más de homología con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4.

4. Una proteína que consiste en un polipéptido, en donde dicho polipéptido se selecciona a partir de un polipéptido que consiste en la secuencia parcial de aminoácidos 8-141 del SEQ ID NO: 4, y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con 80% o más de homología con la secuencia parcial de aminoácidos 8-141 del SEQ ID NO: 4 en donde dichos polipéptidos muestran una actividad de unión a biotina.

5. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es soluble en solución acuosa.

6. Un gen que codifica la proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El gen de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho gen tiene una secuencia de bases de las bases 226651 del SEQ ID NO: 3, o una secuencia de bases que puede hibridar con la secuencia de bases anterior en condiciones rigurosas (NaHPO4 0, 5 M (pH 7, 2) , SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65°C) .

8. Un gen que codifica una proteína que exhibe una actividad de unión a biotina, en donde dicho gen tiene una secuencia de bases de las base.

22. 651 del SEQ ID NO: 3, o una secuencia de bases que puede hibridar con la secuencia de bases anterior en condiciones rigurosas (NaHPO4 0, 5 M (pH 7, 2) , SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65°C) .

9. El gen de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que tiene una secuencia de bases con 80% o más de homología con la secuencia de bases de las base.

22. 651 del SEQ ID NO: 3.

10. El gen de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que tiene una secuencia de bases con 90% o más de homología con la secuencia de bases de las base.

22. 651 del SEQ ID NO: 3.

11. El gen de una cualquiera de las Reivindicaciones 6-8, que tiene una secuencia de bases con 95% o más de homología con la secuencia de bases de las base.

22. 651 del SEQ ID NO: 3.

12. Un oligonucleótido para obtener un gen que codifica una proteína de unión a biotina de Pleurotus cornucopiae, que tiene una secuencia de nucleótidos descrita en una cualquiera de los SEQ ID NO: 16-19.

13. Un método para aislar el gen de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-11, que comprende: realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando dos tipos de oligonucleótidos descritos en la Reivindicación 12 como par de cebadores y una biblioteca de ADNc del cuerpo fructífero de Pleurotus cornucopiae como molde para amplificar una porción del gen que codifica la proteína de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-5; y explorar dicha biblioteca de ADNc mediante el uso del producto de amplificación obtenido de este modo como sonda para aislar el clon de ADNc completo.

14. Un vector recombinante que comprende el gen de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-11.

15. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, que es un vector de expresión.

16. Una célula anfitriona transformada, que se obtiene introduciendo el vector recombinante de la reivindicación 14 o 15 a un organismo anfitrión no humano.

17. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, producido por la célula anfitriona transformada de la reivindicación 16.

18. Un método para producir una proteína de unión a biotina que comprende transformar células anfitrionas por el gen de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-11 y recuperar la proteína de unión a biotina de las fracciones solubles obtenidas a partir de las células anfitrionas rotas.

19. El método para producir una proteína de unión a biotina de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende una etapa de una purificación por afinidad mediante el uso de un análogo de biotina.

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5

FIG. 6

FIG. 7

FIG. 8