Glucoamilasas híbridas.

Enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico de origen fúngico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos,

donde:

- la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID nº: 24, 25 o 26;

- la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID nº: 2 o 18; o difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC 10 ID nº: 20 en no más de posiciones de aminoácidos.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10152450.

Solicitante: NOVOZYMES NORTH AMERICA, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 77 Perry Chapel Church Road Franklinton, North Carolina 27525 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: DANIELSEN,STEFFEN, BORCHERT,TORBEN, ALLAIN,ERIC.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H21/04 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C07K14/32 C07 […] › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Bacillus (G).
  • C07K14/37 C07K 14/00 […] › de hongos.
  • C07K14/375 C07K 14/00 […] › de Basidiomycetes.
  • C07K14/38 C07K 14/00 […] › de Aspergillus.
  • C07K14/385 C07K 14/00 […] › de Penicillium.
  • C12N9/24 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
  • C12N9/34 C12N 9/00 […] › Glucoamilasa.

PDF original: ES-2490616_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Glucoamilasas híbridas

REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS

[0001] Esta aplicación contiene un Listado de Secuencias en forma legible para el ordenador.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a un híbrido entre al menos un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y al menos el módulo catalítico (CM) de una glucoamilasa; una secuencia de ADN que codifica una enzima híbrida de la invención; un constructor de ADN que comprende una secuencia de ADN de la invención; un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de la invención; una célula huésped transformada con un vector de la invención; y el uso de una enzima híbrida de la invención.

Descripción de la técnica relacionada

[0003] Se ha descrito un gran número de procesos para convertir almidón en hidrolizados de almidón, tales como maltosa, glucosa o jarabes especializados, ya sea para usarse como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tales como fructosa. La glucosa también puede fermentarse a etanol u otros productos de fermentación.

[0004] El almidón es un polímero de alto peso molecular que consiste en cadenas de unidades de glucosa. Normalmente consiste en aproximadamente un 80 % de amilopectina y un 20 % de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado en el cual las cadenas lineales de residuos de alfa-1,4-D-glucosa se unen por enlaces alfa- 1,6-glucosídicos.

[0005] La amilosa es un polisacárido lineal formado por unidades D-glucopiranosa enlazadas juntas por enlaces alfa- 1,4-glucosídicos. En el caso de convertir almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón se despollmerlza. El proceso de despolimerización convencional consiste en una etapa de gelatinización y dos etapas de proceso consecutivas, llámense un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación.

[0006] El almidón granulado consiste en gránulos microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando una suspensión de almidón acuosa se calienta, los gránulos se hinchan y eventualmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" se da un dramático incremento en la viscosidad. Ya que el nivel de sólidos es del 30-40 % en un proceso industrial típico, el almidón tiene que adelgazarse o "licuarse" para que se pueda manejar. Esta reducción en la viscosidad se obtiene actualmente en gran parte por la degradación enzimática. Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en unidades ramificadas y lineales más pequeñas (maltrodextrinas) por una alfa-amllasa. El proceso de licuefacción se lleva a cabo típicamente a aproximadamente 105-110° C durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguido por aproximadamente 1-2 horas a una temperatura de aproximadamente 95° C. La temperatura se baja después a 60° C, se agregan una glucoamilasa o una beta-amilasa y opclonalmente una enzima de desramificación, tal como una isoamilasa o una pululanasa, y el proceso de sacarificación procede durante aproximadamente 24 a 72 horas.

[0007] Los procesos de conversión de almidón convencionales consumen mucha energía debido a los diferentes requerimientos en términos de temperatura durante las diferentes etapas. Es entonces deseable poder seleccionar y/o diseñar enzimas usadas en el proceso de tal forma que el proceso total pueda llevarse a cabo sin tener que gelatinizar el almidón.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] La invención proporciona en un primer aspecto una enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico de origen fúngico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, donde:

la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico tiene al menos un 90 % de Identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID n°: 24, 25 o 26;

la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID n°: 2 o 18; o difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n°: 20 en no más de 10 posiciones de aminoácidos.

El módulo catalítico puede ser preferentemente de origen fúngico, bacteriano o vegetal.

[0009] En otros aspectos la invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un constructo de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, y una célula huésped transformada con un vector; dicha célula huésped siendo capaz de expresar la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto.

[0010] En un aspecto final la invención se refiere al uso de una enzima híbrida de la invención para producir productos de fermentación, tales como etanol o jarabe.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0011] La figura 1 compara el rendimiento de etanol por gramo de DS de dos híbridos glucomilasa-SBM (Módulo de Unión a Almidón) (TEAN-1 y TEAN-3) que comprenden el dominio catalítico de T. emersonii y el SBM de A. niger con la glucoamilasa de Talaromyces emersonii de tipo silvestre.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0012] El término "almidón granulado" se entiende como almidón crudo no cocido, es decir, almidón que no se ha sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como pequeños gránulos insolubles en agua. Estos gránulos se conservan en almidones a temperaturas inferiores a la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se ponen en agua fría, los gránulos pueden absorber una pequeña cantidad de líquido. Hasta 50° C a 70° C el hinchamiento es reversible, dependiendo el grado de reversibilidad del almidón particular. Con temperaturas más altas comienza un hinchamiento irreversible llamado gelatinización.

[0013] El término "temperatura de gelatinización inicial" se entiende como la temperatura mínima a la que comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua se empieza a gelatinizar entre 50° C y 75° C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y se puede determinar fácilmente por el experto en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie vegetal, la variedad particular de la especie vegetal así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura a la cual la birrefringencia se pierde en un 5 % de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/Stárke, Vol. 44 (12) págs. 461-466 (1992).

[0014] El término "hidrolizado de almidón soluble" se entiende como los productos solubles del proceso de la invención y pueden comprender mono-, di-, y oligosacáridos, tales como glucosa, maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla de éstas. Preferiblemente al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos el 99 % de los sólidos secos del almidón granulado se convierten en un hidrolizado de

almidón soluble.

[0015] El término "homología" de polipéptidos se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede determinarse adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, 10 de agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se usan los ajustes siguientes para comparar las secuencias de aminoácidos: penalización de creación GAP de 3.0 y penalización de extensión GAP de 0.1.

Enzimas híbridas

[0016] Los números de clasificación de enzimas (números EC) referidos en la presente descripción con las reivindicaciones están de acuerdo con las Recomendaciones (1992) del Comité de Nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press Inc., 1992.

[0017] Las enzimas híbridas mencionadas en la presente incluyen especies que comprenden una secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa (EC 3.2.1.3) enlazada (es decir, unida covalentemente) a una secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos (CBM). El término "módulo de unión... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico de origen fúngico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, donde:

la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID n°: 24, 25 o 26;

la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID n°: 2 o 18; o difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n°: 20 en no más de 10 posiciones de aminoácidos.

2. Enzima híbrida según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos deriva de Aspergillus sp, Athelia sp. o Talaromyces sp.

3. Enzima híbrida según las reivindicaciones 1 o 2, donde la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos mostrado en la SEC ID n°: 2 deriva de Aspergillus kawachir, y la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos mostrada en la SEC ID n°: 18 deriva de Aspergillus Niger.

4. Enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el módulo catalítico mostrado en la SEC ID n°: 24 deriva de una cepa de Aspergillus Niger o Aspergillus oryzae\ el módulo catalítico mostrado en la SEC ID n°: 26 deriva de Athelia rolfsir, y el módulo catalítico mostrada en la SEC ID n°: 25 deriva de Talaromyces emersonii.

5. Secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Constructo de ADN que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 5.

7. Vector de expresión que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 5.

8. Célula huésped transformada con un vector de la reivindicación 7 cuya célula huésped es capaz de expresar la secuencia de ADN de la reivindicación 5.

9. Uso de una enzima híbrida de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para producir un producto de fermentación o jarabe.

10. Uso según la reivindicación 9 para producir etanol.


 

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