VACUNA CONTRA PIROPLASMIDOS.

Proteína de Piroplásmido, caracterizada por que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº:

2, o un fragmento antigénico que contienen epítopo de dicha proteína

Vacuna contra piroplásmidos.

La invención se refiere a una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, a un ácido nucleico que codifica dicha proteína de Piroplásmido o dicho fragmento inmunogénico, a fragmentos de ADNc, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos que comprenden dicho ácido nucleico, a células hospedadoras que comprenden dichos fragmentos de ADNc, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos, a vacunas que comprenden una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, a métodos para la preparación de tales vacunas, al uso de tales proteínas o fragmentos y a ensayos de diagnóstico.

La babesiosis es una enfermedad que tiene una existencia geográficamente focal. El motivo de esto es que el patógeno se transmite por garrapatas que alimentan un cierto reservorio de parásitos presente en una población de vertebrados. Solamente donde existen garrapatas puede aparecer la Babesiosis. Teniendo en cuenta todos los factores, particularmente en animales autóctonos, el parásito coexiste con el hospedador sin provocar enfermedad significativa. En muchos casos, la Babesiosis se convierte en un problema debido a actividades del ser humano por endogamia de rasgos genéticos y/o transporte de animales a entornos no familiares en los que la Babesiosis es endémica (Callow, L. L. y Dalgliesh, R. J., 1982, en: Immunology of Parasitic Infections, Cohen, S. y Warren, K. S. eds., págs. 475-526, Blackwell Scientific).

La babesiosis también representa un reto como agente zoonótico para seres humanos, no solamente para seres humanos inmunocomprometidos (Gray et al., 2002, int. J. Med. Microbiol., vol. 291, págs. 108-11).

Los signos de enfermedad en Babesiosis adquirida de forma natural comienzan habitualmente 7-21 días después de la infección. Estos síntomas incluyen: fiebre, anorexia, depresión, anemia, hemoglobinuria y debilidad de desarrollo rápido. Aparecen de forma común lagrimeo aumentado, salivación y temblor muscular. Se pueden desarrollar signos nerviosos en infecciones terminales y puede ocurrir la muerte cuando no se trata la enfermedad. Las alteraciones de la coagulación conducen a adhesividad aumentada de eritrocitos. Como resultado, el paso de la sangre a través de la microvasculatura está impedido, dando como resultado congestión de órganos internos y hematocritos (PCV) disminuidos. También la ruptura de eritrocitos infectados provoca pérdida de grandes números de eritrocitos. Estos efectos alteran al suministro de oxígeno a varios tejidos y, posteriormente, conducen a lesión tisular como resultado de anoxia.

Ahora se ha detectado que especies de los Babesiidae infectan la mayor parte de las especies de mamífero de importancia veterinaria (Kuttler, K. L., en M. Risticed.: Babesiosis of domestic animals and man. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1988): Vaca (B. divergens, B. bovis, B. bigemina), Cerdo (B. trautmanni, B. perroncitoi), Oveja (B. ovis, B. motasi), Caballo (B. equi, B. caballi), Perro (B. canis, B. rossi, B. vogeli) y Gato (B. felis, B. cati). En todas estas especies, la muerte o pérdidas económicas más o menos graves (reducción en la calidad o cantidad de carne, leche, lana o descendencia) o una reducción grave en el bienestar están provocadas como resultado de la infección por Babesia directamente o por facilitación de infecciones secundarias.

Los parásitos Theileria están estrechamente relacionados con Babesia. Estos también pertenecen al grupo taxonómico de los Piroplásmidos y muestran muchas relaciones biológicas y epidemiológicas con Babesia. Son especies de Theileria bien conocidas de importancia veterinaria T. parva, T. annulata y T. sergenti.

Existen medicaciones para curar una infección establecida por Babesia o Theileria, por ejemplo, los perros, caballos y vacas se pueden tratar con dipropionato de imidocarb. Sin embargo, tal inyección es dolorosa debido a la irritación tisular. Adicionalmente, adolece de los inconvenientes comunes de tales antiparasitarios: la prevención de una generación de memoria inmunológica, potencial toxicidad y posible generación de resistencia.

Se ha demostrado que la Babesiosis y Theileriosis se pueden controlar por vacunación con vacunas vivas (revisado en: Jenkins, M. 2001, Vet Parasitol., vol. 101, págs. 291-310). Tales vacunas se producen recogiendo eritrocitos de animales infectados. Para algunas, pero no todas las especies de Babesia se han desarrollado cultivos de eritrocitos in vitro para aumentar el número de parásitos. Los eritrocitos infectados del animal o los cultivos, también conocidos como productos estabilizados, después se usan para vacunar animales.

Los productos estabilizados para Theileria se producen de un modo similar. De hecho, debido a que la necesidad de una vacuna eficaz es tan alta, se han producido incluso productos estabilizados de Theileria a partir de las glándulas salivales de garrapatas infectadas.

Las desventajas generales de tales vacunas parasitarias vivas son que el material de inoculación está en gran medida incontrolado, es altamente variable en su composición, es biológicamente inseguro y que todo el proceso no es ético por el uso de un gran número de animales de experimentación. Adicionalmente, los parásitos Piroplásmidos son muy inestables; se tienen que alejar de oxígeno libre o morirán rápidamente.

Alternativamente, los propios eritrocitos infectados por parásitos no se usan para la vacunación, sino el suero del hospedador infectado o el sobrenadante de un cultivo in vitro. Tales líquidos circundantes de eritrocitos infectados contienen los denominados Antígenos Parasitarios Solubles (SPA). Se conoce poco acerca de la composición de estas preparaciones. Se ha sugerido que la actividad protectora se debe a la capacidad inmunizante de antígenos de la cubierta superficial del merozoito en el suero o medio, una estructura que se deja atrás durante el proceso de invasión del eritrocito (Ristic, M. y Montenegro-James, S., 1988, en: Babesiosis of Domestic Animals and Man, Ristic, M. ed., págs. 163-190, CRC Press). Además, durante el cultivo in vitro varios parásitos mueren, por lo tanto, se liberan antígenos parasitarios (internos) al medio de cultivo.

Tales preparaciones de SPA son capaces de inducir una respuesta inmune que, aunque no afecta necesariamente al parásito, reduce suficientemente las manifestaciones clínicas de la infección (Schetters y Montenegro-James, S., 1995, Parasitology Today, vol. 11, págs. 456-462). Por ejemplo, los SPA del sobrenadante de cultivo de un cultivo in vitro de eritrocitos infectados por el parásito Babesia canis (Pirodog®) induce inmunidad contra infección de exposición homóloga (pero no heteróloga).

En general, las vacunas basadas en SPA conllevan las mismas desventajas que vacunas parasitarias vivas, porque están en gran medida no caracterizadas, son altamente variables y requiere muchas precauciones para que sean biológicamente seguras. Adicionalmente, la producción de tales vacunas es muy difícil de aumentar de escala, ya que eso requiere la infección, alojamiento y recogida de muestras de animales de experimentación para proporcionar parásitos, eritrocitos y/o suero.

El documento publicado como documento WO 90/11776 describe proteínas de Babesia bovis, que se expresan sobre la superficie del merozoito de Babesia bovis. Estas proteínas, que son diferentes de las de la presente invención, se describen para el uso en vacunación y diagnóstico.

Es un objeto de la invención proporcionar proteínas y fragmentos de las mismas que pueden servir en vacunas eficaces para la prevención o mitigación de infección con un organismo Piroplásmido, que estén bien definidas, sean seguras, estables y con una producción que sea fácil de aumentar de escala.

Ahora se ha observado sorprendentemente que una vacuna que comprende una proteína de Piroplásmido novedosa o un fragmento inmunogénico de dicha proteína incorpora todas estas características ventajosas.

Ahora se pueden superar muchas desventajas de vacunas de parásitos vivas y SPA mediante el uso de tal proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína en vacunas. Tal proteína está altamente definida, es biológicamente segura, el producto se puede estabilizar mucho mejor que parásitos vivos completos y su producción se puede aumentar de escala de manera sencilla.

Se observó sorprendentemente...

1. Proteína de Piroplásmido, caracterizada por que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº: 2, o un fragmento antigénico que contienen epítopo de dicha proteína.

2. Ácido nucleico, caracterizado por que dicho ácido nucleico codifica una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína.

3. Fragmento de ADNc que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor unido funcionalmente.

5. Microorganismo portador recombinante vivo que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor unido funcionalmente o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor unido funcionalmente, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, o un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Vacuna que comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 5, o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que dicha vacuna comprende un adyuvante.

9. Vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, caracterizada por que dicha vacuna comprende un componente inmunoactivo adicional o un ácido nucleico que codifica dicho componente inmunoactivo adicional.

10. Vacuna, caracterizada por que dicha vacuna comprende un anticuerpo contra una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o un anticuerpo contra un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína o una combinación de los mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Método para la preparación de una vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, comprendiendo dicho método la mezcla de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 5, o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína para la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus signos clínicos provocados por un organismo Piroplásmido.

13. Uso de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 5 o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6 para la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus signos clínicos provocados por un organismo de Piroplásmido.

14. Ensayo in vitro de diagnóstico para la detección de un ácido nucleico asociado con un organismo Piroplásmido, caracterizado por que el ensayo comprende un ácido nucleico, siendo dicho ácido nucleico al menos el 70% similar a la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEC ID Nº: 1, o un ácido nucleico que es complementario a dicho ácido nucleico, donde el ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos.

15. Ensayo in vitro de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra un organismo Piroplásmido, caracterizado por que dicho ensayo comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, o una combinación de los mismos.

16. Ensayo in vitro de diagnóstico para la detección de material antigénico de un organismo Piroplásmido, caracterizado por que dicho ensayo comprende un anticuerpo contra una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, o un anticuerpo contra un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, o una combinación de los mismos.