Medios y métodos para distinguir el FECV y el FIPV.

Un método para determinar si está presente el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) en una muestra,

que comprende determinar si dicha muestra comprende un coronavirus felino, y si un coronavirus felino está presente determinar la identidad de un aminoácido en una proteína de la espícula de dicho coronavirus felino en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 1049 como se describe en la figura 2B, y determinar que FIPV está presente si dicho aminoácido es leucina.

Medios y métodos para distinguir el FECV y el FIPV

La invención se refiere al campo del diagnóstico veterinario, más específicamente la invención se refiere al campo de los coronavirus felinos y a la identificación de los mismos.

Los coronavirus felinos (FCoVs) son patógenos comunes de Félidos domésticos y no domésticos, que incluyen pero sin limitarse a gatos, leones, tigres, leopardos, jaguares, linces, caracales, guepardos, pumas y servales. En entornos con varios gatos domésticos se alcanza hasta el 90% de seropositividad a FCoV. Los FCoV se relacionan estrechamente con el coronavirus canino (CCoV) y el virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV) de los cerdos. Existen dos serotipos, I y II, de FCoV de los cuales predomina el serotipo I, con un 80-95% de las infecciones FCoV. El tipo II FCoV presumiblemente resulta de la recombinación de ARN en animales que se infectan doblemente por el FCoV serotipo I y el CCoV, durante la cual un gen de la espícula del CCoV o parte del mismo se incorpora en el genoma del FCoV, al parecer un evento que ocurre con poca frecuencia. El coronavirus entérico felino (FECV) es el patotipo más común de FCoV, tanto para el serotipo I como para el serotipo II. El FECV se limita principalmente a los intestinos, se propaga a través de la vía oral-fecal, y es altamente contagioso. La infección por FECV generalmente ocurre de manera no aparente; a veces, sin embargo, provoca síntomas tales como enteritis leve (Haijema y otros, 2007) .

En la década de 1970 la peritonitis infecciosa felina (FIP) , una enfermedad (entonces) poco frecuente pero grave en los gatos, se informó que la causa un coronavirus felino, que se llamó virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) . Contrariamente al FECV, el FIPV es altamente virulento. La infección por FIPV puede ser granulomatosa (en seco) o efusiva (húmeda) y es una enfermedad progresiva y generalmente fatal. Los síntomas de la FIP incluyen retraso del crecimiento en gatos jóvenes, cojera, fluctuación de la fiebre, inapetencia y pérdida de peso lo que resulta en la muerte (Pedersen 2009) . Una desregulación dramática del sistema inmune adaptativo acompaña la progresión de la FIP como se demuestra por la hipergammaglobulinemia y el agotamiento de células T linfoides y periféricas (Haijema y otros, 2007) . Mientras que el FECV se limita al intestino, el FIPV es capaz de infectar -y replicarse en -monocitos y macrófagos lo que causa una enfermedad sistémica con afectación de múltiples órganos.

Existen dos teorías predominantes sobre el origen del FIPV. De acuerdo con la "hipótesis de la mutación", el FIPV se origina a partir del FECV por mutación de novo en felinos infectados lo que resulta en un virus FIP altamente virulento. La mutación que dio lugar al FIPV no se identificó pero se ha propuesto que ocurre en los genes no estructurales 3c, 7a o 7b (véase la figura 1) , que codifican proteínas con función desconocida (Vennema y otros, 1998, Polonia y otros, 1996, Kennedy y otros, 2001, Pedersen 2009) . Por lo tanto se cree que una mutación en el gen 3c, 7a o 7b o una combinación de mutaciones en estos genes altera las propiedades biológicas del virus lo que permite que el coronavirus entérico infecte monocitos y macrófagos con lo que extiende de esta manera la infección a los órganos y causa FIP (Pedersen 2009) : la transición de FECV a FIPV. La hipótesis de la mutación no se demostró formalmente.

De acuerdo con otra teoría, dos cepas distintas de FECV circulan en poblaciones naturales, una cepa virulenta y una no virulenta, y sólo los felinos que se infectan por la cepa virulenta desarrollarán FIP (Brown y otros, 2009) . Brown y otros (2009) aislaron secuencias virales de gatos que sufrían de FIP, y de gatos asintomáticos (sanos) pero infectados con FECV. Mediante el uso de análisis filogenéticos se encontraron con que secuencias virales distintas están presentes en gatos enfermos y gatos sanos. Dye y Siddell (2007) compararon las secuencias virales de coronavirus felinos aislados del yeyuno y del hígado de un gato que sufría de FIP. De acuerdo con la teoría de la mutación, el FECV se limita a los intestinos, mientras que el FIPV, que es capaz de infectar a macrófagos y monocitos, está presente en el hígado. Sin embargo, Dye y Siddell encontraron 100% de identidad de nucleótidos y así cuestionaron la hipótesis de la mutación según el cual el coronavirus del hígado es un coronavirus del yeyuno mutado. Ellos sugirieron que en los gatos que sufren de FIP la misma cepa de coronavirus felino virulenta estaba presente tanto en el hígado como en el yeyuno.

Anteriormente, los presentes inventores identificaron una serie de diferencias en la proteína de la espícula del FIPV 79-1146 y del coronavirus felino FECV 79-1683 adaptados a cultivo de tejidos (Rottier y otros, 2005) . El FIPV 79-1146 contenía varias mutaciones en el dominio C-terminal de la proteína de la espícula, el dominio S2. Sin embargo, el FECV 79-1683 y el FIPV 79-1146 no son coronavirus felinos prototípicos y no son por lo tanto representativos para el FIPV y el FECV serotipo I con que se infectan la mayoría de los gatos (Pedersen 2009) . En primer lugar, los coronavirus felinos serotipo II se originan a partir de la recombinación de ARN de coronavirus caninos y felinos y contienen la proteína de la espícula del coronavirus canino. Las proteínas de la espícula de los coronavirus felinos y caninos tienen sólo aproximadamente un 45% de identidad de secuencia de aminoácidos (Motokawa y otros, 1996) . En segundo lugar, el FECV 79-1683 y el FIPV 79-1146 son adaptados a cultivo de tejidos de líneas celulares que no sean macrófagos. Debido a que el FIPV infecta monocitos y

macrófagos in vivo, el tropismo de estas cepas de laboratorio difiere de los coronavirus felinos prototípicos. En tercer lugar, el FIPV 79-1146, a diferencia del FIPV serotipo I que infecta monocitos y macrófagos, es excepcionalmente virulento por cada vía común de infección (Pedersen 2009) . En cuarto lugar, el FECV 79-1683 no puede calificarse como un verdadero FECV como se argumentó extensamente por Pedersen en su reciente revisión (Pedersen, 2009) . En particular, el FECV 79

1.683 carece de la mayoría del gen 7b, que está presente en las cepas de FECV no adaptadas a cultivo de tejidos y tiene una mutación deletérea en su gen 3c, lo que indica que puede tener su origen a partir de un FIPV.

La infección por coronavirus felinos se demuestra generalmente por la presencia de anticuerpos en la sangre. No existe un tratamiento o vacuna eficaz para la infección por FIPV. Los gatos que desarrollan FIP mueren en cuestión de días o semanas -en el caso de FIP efusiva -o meses, en el caso de la FIP seca o granulomatosa. La solicitud de patente japonesa JP 7 327683 describe una proteína de la espícula del FIPV tipo 1, que contiene una leucina en la posición 1049, y su uso para la preparación de una vacuna. Una vacuna disponible comercialmente que consiste en un mutante de una cepa de FIPV sensible a la temperatura no demostró convincentemente su eficacia protectora en una serie de estudios de inmunización (McArdle y otros, 1995; Fehr y otros, 1997) . Además, hasta la fecha no existe ninguna prueba de diagnóstico para discriminar entre FECV y FIPV, aunque WO 94/13836 y WO 95/08575 describen anticuerpos monoclonales que son reactivos con FIP pero no con FECV.

WO 02/066686 describe un método para distinguir el FIPV del FECV, en donde el ácido nucleico de la región M de un genoma de coronavirus se detecta en las células no entéricas de un gato.

Un factor adicional que complica la situación es que el cuadro clínico de la FIP es muy variable y, como consecuencia, la enfermedad no es fácil de establecer de manera inequívoca. El diagnóstico es frecuentemente una presunción, en base a parámetros anamnésicos, clínicos y no específicos de laboratorio. Debido a que no hay ninguna prueba de diagnóstico específica para el FIPV, frecuentemente tampoco es posible discriminar entre la FIP y otras enfermedades con síntomas solapados. Tanto las pruebas de diagnóstico para y vacunas contra el FIPV son muy necesarias debido a la evolución progresiva y debilitante de la FIP.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar medios y métodos para distinguir el FIPV y el FECV.

Los presentes inventores encontraron que el FIPV alberga una alteración específica con relación al FECV en la proteína de la espícula en la posición de aminoácido 1049 como se representa en la figura 2B.

La invención por lo tanto proporciona un método para identificar el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) que comprende determinar la identidad de un aminoácido de una proteína de la espícula del coronavirus... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones

1. Un método para determinar si está presente el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) en una muestra, que comprende determinar si dicha muestra comprende un coronavirus felino, y si un coronavirus felino está presente determinar la identidad de un aminoácido en una proteína de la espícula de dicho coronavirus felino en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 1049 como se describe en la figura 2B, y determinar que FIPV está presente si dicho aminoácido es leucina.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la identidad del aminoácido en la posición 1049 se determina al determinar una secuencia de ácido nucleico de un ácido nucleico del coronavirus felino que codifica una proteína de la espícula, dicho ácido nucleico que comprende un nucleótido en, o que corresponde a, la posición 3145, 3146 y/o 3147 como se describe en la figura 2A.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, que además comprende amplificar al menos parte de una molécula de ácido nucleico de coronavirus felino que comprende una región que incluye, o que corresponde a, la posición de nucleótidos 3145, 3146 y 3147 como se describe en la figura 2A mediante el uso de al menos un iniciador que es capaz de hibridarse a al menos parte de dicha secuencia de ácido nucleico entre una posición que corresponde a la posición de nucleótido 3055 y una posición que corresponde a la posición de nucleótido 3669 como se describe en la figura 2A.

4. Un método para determinar si está presente el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) en una muestra, que comprende determinar si dicha muestra comprende un coronavirus felino, y si está presente un coronavirus felino determinar la identidad de un aminoácido en una proteína de la espícula de dicho coronavirus felino en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 1051 como se describe en la figura 2B, y determinar que el FIPV está presente si dicho aminoácido es alanina.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que además comprende determinar la identidad de un aminoácido en una proteína de la espícula de dicho coronavirus felino en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 1051 como se describe en la figura 2B, y determinar que el FIPV está presente si dicho aminoácido es alanina.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde la identidad del aminoácido en la posición 1051 se determina al determinar una secuencia de ácido nucleico de un ácido nucleico del coronavirus felino que codifica una proteína de la espícula, dicho ácido nucleico que comprende un nucleótido en, o que corresponde a, la posición 3151, 3152 y/o 3153 como se describe en la figura 2A.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, que además comprende amplificar al menos parte de una molécula de ácido nucleico del coronavirus felino que comprende una región que incluye, o que corresponde a, la posición de nucleótidos 3151, 3152 y 3153 como se describe en la figura 2A mediante el uso de al menos un iniciador que es capaz de hibridarse a al menos parte de dicha secuencia de ácido nucleico entre una posición que corresponde a la posición de nucleótido 3055 y una posición que corresponde a la posición de nucleótido 3669 como se describe en la figura 2A.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 o 7, en donde dicho al menos un iniciador se selecciona de los iniciadores enumerados en la tabla 1.

9. Un par iniciador que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada o recombinante que comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuenci.

5. CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3' y una secuencia de ácido nucleico aislada o recombinante que comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuenci.

5. CAATATTACAATGGCATAATGG-3'.

10. Un par iniciador que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada o recombinante que comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuenci.

5. GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3' y una secuencia de ácido nucleico aislada o recombinante que comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuenci.

5. TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3'.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en donde dicha secuencia de ácido nucleico se detecta mediante el uso de una sonda con una longitud de al menos 14 nucleótidos que es capaz de hibridarse específicamente a al menos parte de un ácido nucleico del coronavirus felino que comprende un nucleótido en, o que corresponde a, la posición 3145, 3146 y 3147 como se describe en la figura 2A, o que es capaz de hibridarse específicamente a al menos parte de un ácido nucleico del coronavirus felino que comprende un nucleótido en, o que corresponde a, la posición 3151, 3152 y 3153 como se describe en la figura 2A, dicha parte que tiene una longitud de al menos 14 nucleótidos.

12. Una sonda con una longitud de entre 14 y 100 nucleótidos, que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuenci.

5. CCCARRGCCATAGG-3'.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-8 u 11, que además comprende la secuenciación de al menos parte de una secuencia de ácido nucleico de coronavirus felino, dicha parte comprende un nucleótido que corresponde a la posición de nucleótidos 3145, 3146 y/o 3147, o un nucleótido que corresponde a la posición de nucleótidos 3151, 3152 y/o 3153 como se representa en la figura 2A.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, 4 o 5, en donde se detecta un aminoácido de una proteína de la espícula del coronavirus felino en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 1049 o 1051 como se describe en la figura 2B al usar un anticuerpo o equivalente funcional de él dirigido específicamente contra un epítopo de una proteína de la espícula de FIPV, cuyo epítopo comprende un aminoácido distinto a la metionina en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 1049 o un aminoácido distinto a la serina en una posición que corresponde a la posición de aminoácidos 1051 como se describe en la figura 2B.

15. Una composición inmunogénica que comprende:

- una proteína de la espícula del coronavirus felino o parte inmunogénica de ella que comprende una alanina en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 1051 como se describe en la figura 2B, o -un ácido nucleico de coronavirus felino codificador de una proteína de la espícula, que comprende una citosina en una posición que corresponde a la posición de nucleótido 3145, y/o una guanina en una posición que corresponde a la posición de nucleótido 3151 como se describe en la figura 2A, o una combinación de éstos.

16. Uso de:

- una proteína de la espícula del coronavirus felino o parte inmunogénica de ella que comprende una alanina en una posición que corresponde a la posición de aminoácido 1051 como se describe en la figura 2B, o -un ácido nucleico del coronavirus felino codificador de una proteína de la espícula, que comprende una citosina en una posición que corresponde a la posición de nucleótido 3145, y/o una guanina en una posición que corresponde a la posición de nucleótido 3151 como se describe en la figura 2A, o una combinación de éstos, para la preparación de una composición inmunogénica o agente profiláctico para provocar una respuesta inmune contra un coronavirus felino, preferentemente un virus de la peritonitis infecciosa 45 felina (FIPV) , en un felino.