Métodos para detectar inhibidores de JAK3.

Un método in vitro para detectar compuestos que inhiben JAK3 útiles para tratar la osteoartritis,

comprendiendo elmétodo:

(a) poner en contacto JAK3 con un compuesto candidato, y

(b) detectar una disminución de la actividad de JAK3.

Métodos para detectar inhibidores de JAK3

Referencia cruzada con la Solicitud Relacionada Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/177.872, presentada el 24 de enero de 2000.

Campo de la invención La presente invención se encuentra en el campo de la biología molecular y la ortopedia. La presente invención se dirige a métodos para detectar compuestos que inhiben JAK3 útiles para el tratamiento de la osteoartritis o de enfermedades o trastornos que implican una degradación del cartílago, tal y como se especifica en las reivindicaciones. La presente descripción se dirige a nuevos métodos para tratar enfermedades o trastornos mediados por JAK/STAT, particularmente enfermedades o trastornos mediados por JAK3 empleando inhibidores de JAK3.

Antecedentes de la invención Biología de la enfermedad articular degenerativa El cartílago articular cubre los extremos de los huesos largos dentro de las articulaciones sinoviales para proteger el hueso subyacente contra un cizallamiento normal y fuerzas de compresión que acompañan el soporte del cuerpo y el movimiento. El cartílago se compone de un colágeno de matriz extracelular. Dentro de la matriz de colágeno están contenidos los condrocitos (es decir, células especializadas del cartílago) y la sustancia fundamental. La sustancia fundamental está compuesta por proteoglicanos y agua. El colágeno forma la matriz que imparte resistencia a la tracción, mientras que los proteoglicanos forman grandes agregados que proporcionan resistencia a la compresión (Stockwell, 1991) . Los proteoglicanos son moléculas grandes, hidrófilas fuertemente negativas, que atraen el agua. A presión normal de la función articular, el agua se exprime desde el cartílago para lubricar la superficie de la articulación. Una vez que se alivia la presión, el agua es absorbida por los proteoglicanos del cartílago. El movimiento del agua también proporciona el transporte de nutrientes y de productos de desecho desde y hacia los condrocitos: no hay riego sanguíneo en el tejido cartilaginoso. El mantenimiento de la integridad del cartílago es sumamente importante. Una carga anormal, ya sea por aumento o disminución, afecta a la integridad física del cartílago, influye sobre el metabolismo celular e induce cambios bioquímicos, todos ellos pueden conducir a una degradación del cartílago y al desarrollo de una enfermedad articular degenerativa, como la osteoartritis (OA) (Mow et al., 1992) .

Una enfermedad articular degenerativa, como la OA se presenta de forma extensa en los vertebrados. Se caracteriza como una enfermedad progresiva, irreversible (Mankin y Brandt, 1991) que se produce por la degradación del cartílago. Aunque el nombre de osteoartritis sugiere una enfermedad o trastorno inflamatorio, la OA surge de procesos bioquímicos dentro de cartílago que conducen a una degradación del cartílago. En este sentido, la OA se distingue de la artritis reumatoide (AR) y de las espondiloartropatías seronegativas. A diferencia de la AR, en la que la membrana sinovial es la fuente primaria de enzimas degradativas, en la OA, los condrocitos son la fuente principal de enzimas responsables del catabolismo del cartílago. Sin embargo, respuestas inflamatorias ocasionales y transitorias, son frecuentemente una complicación secundaria distinta, asociada a la progresión de la OA (Goldring, 1999) .

Aunque el acontecimiento (s) iniciador del desarrollo de la OA es aún desconocido, la patogénesis de la OA implica probablemente una interacción de factores mecánicos extrínsecos y el metabolismo intrínseco del cartílago. Las causas básicas de la OA pueden variar desde un trauma físico del cartílago (OA secundaria) a cambios metabólicos que afectan a los procesos normales de mantenimiento del cartílago, a reacciones inflamatorias intermitentes de bajo grado, a trastornos genéticos, en donde todas ellas pueden inducir enzimas autolíticas (Wilson, 1988, Goldring, 1999) . Independientemente del suceso iniciador o del trauma que puede desencadenar la aparición de la OA, el modelo aceptado generalmente es que citocinas y/o receptores activados dan como resultado una transducción de señales al núcleo de los condrocitos, induciendo la expresión génica de enzimas que degradan el cartílago y de agentes inflamatorios.

Una lesión directa del cartílago también puede causar lesiones en los condrocitos. Los condrocitos pueden responder a la lesión produciendo enzimas de degradación e induciendo procesos de reparación inapropiados (Mow, et al., 1992) . Los cambios bioquímicos en la OA afectan a diversos componentes del cartílago, incluyendo los agregados de proteoglicanos y colágenos. Los productos de la degradación de proteoglicanos se han identificado en el líquido sinovial de pacientes con OA (Lohmander et al., 1993) . La disminución del contenido en proteoglicanos junto con un colágeno degradado conduce a una pérdida funcional de las propiedades fisiológicas normales de la matriz.

La descomposición enzimática de la matriz cartilaginosa es un factor clave en la aparición de la enfermedad articular degenerativa y su progresión (Pelletier et al., 1992; Pelletier et al., 1993) . Las enzimas que degradan el cartílago conocidas por tener un papel principal en la patología de la OA, incluyen metaloproteasas de la matriz (MMPs) , agrecanasas y serina y tiol proteasas (Pelletier et al., 1997) .

Las metaloproteasas de la matriz que participan en la OA incluyen colagenasas, estromelisinas y gelatinasas. Las colagenasas son responsables de la degradación del entramado del colágeno de tipo II en el cartílago. La colagenasa-1 (MMP-1) y la colagenasa-3 (MMP-13) han sido identificadas in situ en el cartílago de OA. Los niveles de colagenasa-1 y colagenasa-3 se correlacionan con la gravedad histológica del cartílago afectado por OA (Reboul et al., 1996) . Las estromelisinas y las gelatinasas (que incluyen la gelatinasa-A y B, también conocidas como MMP-2 y MMP-9, respectivamente) son metaloproteoglicanasas que también están implicadas en la OA. Los niveles de estromelisina también se correlacionan con la gravedad histológica de la OA (Dean et al., 1989) . Además, la estromelisina también se ha implicado en la activación de la procolagenasa, amplificando de este modo su efecto general en la patología de OA (Murphy et al., 1987) . Se ha mostrado que la colagenasa de neutrófilos (también conocida como colagenasa-2, o MMP-8) escinde el agrecano en sitios únicos, incluyendo el sitio de escisión de la agrecanasa, aunque no lo suficiente como para ser considerada una agrecanasa verdadera (Arner et al., 1997) . Se cree que estas metaloproteinasas de la matriz son las principales responsables de las lesiones en los componentes de proteoglicano, colágeno II y colágeno IX del cartílago que se producen en la OA (Dean, et al., 1989; Mort, et al., 1993; Buttle, et al., 1993) .

La (s) agrecanasa (s) representa (n) una familia de enzimas que degradan el agrecano, el componente principal de los agregados de proteoglicano en el cartílago. Las agrecanasas se definen por su escisión característica del agrecano entre Glu373-Ala374. Las agrecanasas se han caracterizado recientemente como una subfamilia de la familia de las desintegrinas y las metaloproteasas (ADAM) , que contiene múltiples motivos carboxi de trombospondina que son responsables de la unión a la matriz extracelular. Estos compuestos de desintegrina y metaloproteasa con motivo de trombospondina (ADAMTS) , específicamente ADAMTS-4, ADAMTS-11 y posiblemente ADAMTS-1, poseen una actividad agrecanasa característica específica de la escisión (Abbaszade et al., 1999; Tortorella et al., 1999) .

El óxido nítrico (ON) , un radical libre inorgánico, también se ha implicado en trastornos articulares degenerativos. El ON se sintetiza enzimáticamente a partir de 1-arginina mediante la sintasa de ON (siglas en inglés, NOS) . Dos isoformas de NOS se conocen actualmente; NOS constitutiva (cNOS) y NOS inducible (iNOS) . La medición clínica de los niveles de nitrito y nitrato del líquido sinovial de pacientes con OA, indica la producción de ON en las articulaciones con osteoartritis (Farrell et al., 1992) . Además, se han descrito inhibidores de NOS para suprimir algunos daños artríticos en ratas (McCartney-Francis et al., 1993) .

La ciclooxigenasa 2 (COX 2) desempeña un papel importante en la síntesis de eicosanoides, moléculas que actúan localmente de forma similar a las hormonas, que operan en una amplia variedad de procesos biológicos relacionados con el dolor, la fiebre y la inflamación. Específicamente, COX 2 es necesaria para la síntesis de prostaglandinas, prostaciclinas y tromboxanos, a partir de ácido araquidónico. NF-κB (un heterodímero de p65 y p50)... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para detectar compuestos que inhiben JAK3 útiles para tratar la osteoartritis, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto JAK3 con un compuesto candidato, y 5 (b) detectar una disminución de la actividad de JAK3.

2. Un método celular o tisular in vivo para detectar compuestos que inhiben JAK3 en animales no humanos útil para tratar la osteoartritis, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto JAK3 con un compuesto candidato, y

(b) detectar una disminución de la actividad de JAK3.

3. El método según la reivindicación 1, en donde dicho método comprende poner en contacto el compuesto candidato con una célula o tejido.

4. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho método comprende poner en contacto el compuesto candidato con condrocitos.

5. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho método comprende poner en contacto 15 JAK3 con una genoteca de compuestos candidatos.

6. Un método in vitro para detectar compuestos que inhiben JAK3 útiles para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que implica una degradación del cartílago, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto los condrocitos con un compuesto candidato, y

(b) detectar una disminución de la actividad de JAK3.

7. Un método celular o tisular in vivo para detectar compuestos que inhiben JAK3 en animales no humanos útil para tratar una enfermedad o trastorno que implica una degradación del cartílago, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto condrocitos con un compuesto candidato, y

(b) detectar una disminución de la actividad de JAK3.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4, 6 o 7, en donde dicho método comprende poner en 25 contacto dichos condrocitos con una genoteca de compuestos candidatos.