Método de humanización de moléculas del sistema inmune.

Un método para producir un dominio variable (V) de anticuerpo humanizado,

donde el método comprende:

a) comparar la secuencia de aminoácidos de una región flanqueante (FR) de un dominio variable (V) deanticuerpo no humano con una colección de secuencias de aminoácidos de armazón de anticuerpo humano,

b) seleccionar una secuencia de FR humana a partir de la colección que tenga la mayor identidad de secuenciade aminoácidos con la FR no humana,

c) mutagenizar ADN de la FR no humana para codificar una FR humanizada (huFR) que tiene una secuencia deaminoácidos que es al menos el 75% idéntica a la FR humana seleccionada de la etapa b),

d) repetir las etapas a) a c) para cada una de las FR en el dominio V no humano para producir una pluralidad desecuencias de ADN en las cuales cada secuencia de ADN codifica una FR humanizada,

e) sustituir en un primer vector que codifica al menos el dominio V del anticuerpo no humano, cada una de lassecuencias de ADN de huFR de la etapa d) por las FR no humanas correspondientes codificadas por el vector;donde la sustitución une operativamente cada una de las huFR con su región determinante decomplementariedad correspondiente (CDR), y

f) expresar el primer vector en células hospedadoras y en condiciones que conduzcan a preparar el dominio V deanticuerpo humanizado.

Método de humanización de moléculas del sistema inmune

Campo de la invención La presente invención presenta métodos para preparar moléculas del sistema inmune humanizadas. En un aspecto, la invención proporciona métodos para humanizar anticuerpos que implican optimizar la similitud de secuencia entre regiones flanqueantes de anticuerpo individuales en lugar de una región flanqueante o dominio variable más grande. La invención tiene un amplio espectro de aplicaciones incluyendo uso en la producción de anticuerpos monoclonales humanizados con afinidad de unión adecuada e inmunogenicidad humana minimizada.

Antecedentes de la invención Existe un reconocimiento general de que los anticuerpos tienen usos importantes. Por ejemplo, se conoce que muchos detectan antígeno con especificidad exquisita. Se han informado anticuerpos policlonales y monoclonales. Véase de forma general Molecular Biology of the Cell (B. Alberts et al. Eds. 2ª edición) (1989) Garland Publishing, Inc., Nueva York y referencias citadas en el mismo.

Ha existido interés sustancial hacia la comprensión de la estructura y función del anticuerpo. Por ejemplo, se conoce mucho acerca de la estructura y función de los dominios variables (V) . Casi todos los dominios V de anticuerpo incluyen regiones determinantes de complementariedad hipervariables (“CDR”) y regiones flanqueantes (“FR”) . Para la mayoría de las moléculas de anticuerpo, una CDR única se encuentra separada de otra CDR por medio de una FR intermedia. Se reconoce de forma general que las FR sirven como armazones moleculares que ayudan a posicionar los bucles de CDR en la configuración apropiada para el reconocimiento y unión a antígeno. Véase en general B. Alberts et al., mencionado anteriormente, y referencias citadas en el mismo.

Muchos trabajadores han usado “armazón” para describir las FR en su totalidad a partir de un dominio variable de cadena ligera (VL) o un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo único. Por consiguiente, un dominio V de anticuerpo incluye subconjuntos de regiones flanqueantes individuales (FR1, FR2, FR3 y FR4) en los cuales cada subconjunto está enlazado a su CDR correspondiente (CDR1, CDR2 y CDR3) . Un armazón consiste en los subconjuntos de región flanqueante en su totalidad a partir de un anticuerpo único.

Al menos para algunos anticuerpos, los restos de aminoácidos en las FR se cree que contribuyen a unión a 35 antígeno. Véase Foote, J. y G. Winter (1992) J. Mol. Biol. 224: 487.

Ha habido intentos de uso de anticuerpos monoclonales como agentes terapéuticos. Sin embargo, el enfoque ha sido un reto al menos con determinados anticuerpos. Por ejemplo, se ha informado que algunos sujetos humanos desarrollan reacciones secundarias inmunes indeseables después de exposición a anticuerpos obtenidos a partir de fuentes no humanas. Estas reacciones, en algunos casos, pueden presentar problemas de salud graves y pueden presentar peligro para la vida.

Ha habido intentos de preparación de anticuerpos más inmunológicamente aceptables para los sujetos humanos. Aunque existen algunos informes de anticuerpos monoclonales humanos, se acepta de forma general que 45 tales moléculas son difíciles de preparar y de usar.

Una estrategia alternativa para preparar anticuerpos más aceptables para los seres humanos ha sido introducir genes que codifican anticuerpos humanos en animales no humanos (por ejemplo ratones) . Se ha informado que tales animales “transgénicos” preparan anticuerpos con secuencia humana. Sin embargo, la preparación de tales animales ha sido con frecuencia difícil y ha requerido mucho tiempo. También, estos ratones transgénicos están patentados y poseen menos repertorios de genes de anticuerpo humano que los óptimos.

Otro enfoque para preparar anticuerpos inmunológicamente aceptables ha sido el uso de tecnologías de ADN recombinante. Un concepto ha sido clonar y modificar anticuerpos no humanos de forma que las moléculas 55 resultantes se parezcan a anticuerpos humanos. De forma colectiva, tales anticuerpos se han denominado “humanizados”. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.766.886 de Studnicka et al.; 5.693.762 de Queen et al.; 5.985.279 de Waldeman et al.; 5.225.539 de Winter; 5.639.641 de Pedersen, et al., y referencias citadas en las mismas.

Se han propuesto varios enfoques específicos para humanizar anticuerpos.

Una estrategia implica preparar lo que se ha descrito como una molécula de anticuerpo quimérica. Típicamente, se usa un antígeno para inmunizar un animal no humano tal como un ratón. Después, anticuerpos monoclonales se preparan a partir del animal usando técnicas convencionales. Los genes que codifican el anticuerpo monoclonal se 65 generan usando amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Las secuencias aisladas que codifican dominios variables de anticuerpo murinos se fusionan genéticamente mediante tecnología de ADN recombinante convencional con las secuencias que codifican los dominios constantes de anticuerpos humanos. Esta estrategia se ha usado para preparar un anticuerpo quimérico humano-ratón. Véase, por ejemplo, S.

L. Morrison y V. Oi (1989) Adv. Immunol. 44: 65.

Desafortunadamente, ha habido informes de problemas en la preparación y el uso de algunos anticuerpos quiméricos. Específicamente, se han desvelado respuestas inmunes inaceptables después de la administración de los anticuerpos a sujetos humanos. También se cree que la semivida circulatoria reducida es un problema con al menos algunos anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Boulianne et al. en Nature 312: 643 (1984) ; Junghans et al. Cancer Res. 50: 1495 (1990) y Bruggemann et al. (1989) J. Exp. Med. 170: 2153.

Se han informado estrategias adicionales para preparar anticuerpos humanizados.

Un enfoque se ha descrito como “injerto de CDR” (denominado algunas veces “injerto de armazón” o “reestructuración de anticuerpo”) . Se ha descrito que el injerto de CDR implica la inserción de CDR murinas en un dominio V humano. Las CDR murinas posteriormente se sustituyen por las CDR humanas correspondientes. Véase, Padlan Mol. Immunol. 28: 489 (1991) . Habitualmente, todas las FR en el dominio V se obtienen a partir de un anticuerpo humano único. Algunas personas en el campo han predicho que las FR humanas del armazón posicionarán de forma correcta las CDR murinas para unirse a antígeno. La expectativa ha sido que tales anticuerpos evadirán el reconocimiento por el sistema inmune humano. Véase, por ejemplo, Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986) ; Junghans et al, mencionado anteriormente.

Sin embargo, han existido problemas con el uso de muchas técnicas de injerto de CDR.

Por ejemplo, algunos anticuerpos “injertados” tienen propiedades de unión a antígeno inaceptables. Véase Gorman,

et al. PNAS (Estados Unidos) 88: 4181 (1991) . Los intentos para mejorar la unión a antígeno, habitualmente mediante la adición de restos murinos nuevamente al dominio V injertado con CDR, no han sido siempre satisfactorios. Véase Queen et al, PNAS (Estados Unidos) 86: 10029 (1989) ; y Col, et al, PNAS (Estados Unidos)

88: 2869 (1991) .

Se han realizado intentos adicionales para producir anticuerpos humanizados usando lo que se ha descrito como “resurfacing de anticuerpo” (sustitución selectiva en la superficie de las FR de residuos que difieren de los observados en FR humanas) . Un enfoque ha sido reemplazar los restos de aminoácidos expuestos de un anticuerpo alogénico con aquellos encontrados habitualmente en anticuerpos hospedador. La esperanza ha sido reducir la inmunogenicidad del anticuerpo mientras que se conserva la mayor cantidad de función de unión a antígeno posible.

Véase Roguska, et al. PNAS (Estados Unidos) , 91: 969 (1994) .

Desafortunadamente, ha habido problemas con el uso de muchas de las técnicas de reestructuración de anticuerpo anteriores.

Por ejemplo, muchos anticuerpos reestructurados se cree que muestran propiedades de unión a antígeno inaceptables. Véase E. Padlan Mol. Immunol. 28: 489 (1991) . Además, la mayoría de las técnicas de reestructuración requieren conocimiento detallado acerca de la estructura del anticuerpo que se tiene que reestructurar. Con frecuencia es necesaria información sustancial acerca de la accesibilidad del disolvente y parámetros relacionados. Sin embargo, tal información no está siempre disponible para anticuerpos que necesitan 45 humanizarse.

Una desventaja principal compartida por la mayoría de las técnicas de humanización de anticuerpo es que para que un anticuerpo deseado... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir un dominio variable (V) de anticuerpo humanizado, donde el método comprende:

a) comparar la secuencia de aminoácidos de una región flanqueante (FR) de un dominio variable (V) de anticuerpo no humano con una colección de secuencias de aminoácidos de armazón de anticuerpo humano, b) seleccionar una secuencia de FR humana a partir de la colección que tenga la mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la FR no humana, c) mutagenizar ADN de la FR no humana para codificar una FR humanizada (huFR) que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75% idéntica a la FR humana seleccionada de la etapa b) , d) repetir las etapas a) a c) para cada una de las FR en el dominio V no humano para producir una pluralidad de secuencias de ADN en las cuales cada secuencia de ADN codifica una FR humanizada, e) sustituir en un primer vector que codifica al menos el dominio V del anticuerpo no humano, cada una de las secuencias de ADN de huFR de la etapa d) por las FR no humanas correspondientes codificadas por el vector;

donde la sustitución une operativamente cada una de las huFR con su región determinante de complementariedad correspondiente (CDR) , y f) expresar el primer vector en células hospedadoras y en condiciones que conduzcan a preparar el dominio V de anticuerpo humanizado.

2. El método de la reivindicación 1, donde el dominio V es de una cadena ligera de anticuerpo no humano.

3. El método de la reivindicación 1, donde el dominio V se obtiene a partir de una cadena pesada de anticuerpo no humano.

4. El método de la reivindicación 2 o reivindicación 3, donde la región flanqueante (FR) del dominio V de cadena ligera o pesada, respectivamente, de la etapa a) es FR1.

5. El método de la reivindicación 4, donde la identidad de secuencia entre la FR1 y la FR de armazón humano seleccionada es al menos el 70%.

6. El método de la reivindicación 5, donde la etapa d) comprende además comparar una segunda región flanqueante (FR2) del dominio V de cadena ligera o pesada no humano con la colección y seleccionar una FR humana que tenga al menos el 70% de identidad de secuencia.

7. El método de la reivindicación 6, donde la etapa d) comprende además comparar una tercera región flanqueante (FR3) del dominio V de cadena ligera o pesada no humano con la colección y seleccionar una FR humana que tenga al menos el 70% de identidad de secuencia.

8. El método de la reivindicación 7, donde la etapa d) comprende además comparar una cuarta región flanqueante (FR4) del dominio V de cadena ligera o pesada no humano con la colección y seleccionar una FR humana que tenga al menos el 70% de identidad de secuencia.

9. El método de la reivindicación 8, donde el dominio V de cadena ligera o pesada humanizado comprende unidos

covalentemente en secuencia: huFR1-CDR1-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4 45

10. El método de la reivindicación 2-9, donde los restos de aminoácidos de la zona de vernier en cada FR son idénticos en la FR no humana y humana del dominio V de cadena ligera o pesada de anticuerpo.

11. El método de la reivindicación 3, donde el primer vector comprende además un dominio constante de cadena pesada humano o fragmento del mismo unido covalentemente al dominio V de cadena pesada humanizado.

12. El método de la reivindicación 1, donde la colección de secuencias de aminoácidos humanas comprende secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos completamente secuenciados.

13. El método de la reivindicación 12, donde la colección comprende además secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos parcialmente secuenciados.

14. El método de la reivindicación 11, donde el fragmento de cadena pesada humanizado tiene una longitud de aminoácidos de entre 95 y 540 aminoácidos.

15. Un método como se indica en la reivindicación 1 para preparar un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo, donde el método comprende:

a) comparar la secuencia de aminoácidos de una región de armazón de dominio variable (V) de cadena ligera de 65 anticuerpo no humano (1-FR) con una colección de secuencias de aminoácidos de cadena ligera de anticuerpo humano,

b) seleccionar una secuencia de FR humana a partir de la colección que tenga la mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la 1-FR, c) mutagenizar ADN de la 1-FR para codificar una FR humanizada de cadena ligera (L-huFR) que tenga una secuencia de aminoácidos al menos el 75% idéntica a la FR humana seleccionada de la etapa b) ,

d) repetir las etapas a) a c) para cada una de las FR en el dominio V de cadena ligera para producir una pluralidad de secuencias de ADN en las cuales cada secuencia de ADN codifica una L-huFR, e) sustituir en un primer vector que codifica al menos el dominio V de cadena ligera del anticuerpo no humano, cada una de las secuencias de ADN de L-huFR de la etapa d) para las 1-FR correspondientes codificadas por el vector; donde la sustitución une operativamente cada una de las L-huFR con una región determinante de complementariedad correspondiente (CDR) , f) comparar la secuencia de aminoácidos de una región flanqueante de un dominio variable (V) de cadena pesada de anticuerpo no humano (h-FR) con una colección de secuencias de aminoácidos de cadena pesada de anticuerpo humano, o fragmentos de las mismas, g) seleccionar una secuencia de FR humana a partir de la colección que tenga la mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la h-FR, h) mutagenizar ADN de la h-FR para codificar una FR de cadena pesada humanizada (H-huFR) que tenga una secuencia de aminoácidos al menos el 75% idéntica a la FR humana seleccionada de la etapa g) , i) repetir las etapas f) a h) para cada una de las h-FR en la región V de cadena pesada no humana para producir una pluralidad de secuencias de ADN en las cuales cada secuencia de ADN codifica una H-huFR,

j) sustituir en dicho primer vector o un segundo vector que codifica al menos el dominio V de cadena pesada del anticuerpo no humano, cada una de las secuencias de ADN de H-huFR de la etapa i) por las h-FR correspondientes codificadas por el vector; donde la sustitución une operativamente cada una de las H-huFR con una CDR de cadena pesada correspondiente, y k) expresar el vector o vectores en las mismas células hospedadoras y en condiciones que conduzcan a producir

cadenas ligera y pesada humanizadas y preparar el anticuerpo humanizado o el fragmento del mismo.

16. El método de la reivindicación 15, donde los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada humanizadas o fragmentos de las mismas están contenidos en dicho primer vector y se co-expresan en el mismo hospedador.

17. Los métodos de las reivindicaciones 15 y 16, donde el hospedador es un mamífero, planta, ave o microbio.

18. El método de la reivindicación 2 o 15, donde el primer vector comprende además un dominio constante de cadena ligera humana o un fragmento del mismo unido covalentemente al dominio V de cadena ligera humanizada.

19. El método de la reivindicación 18, donde el dominio constante de cadena ligera es C!, C# o un fragmento del mismo.

20. El método de la reivindicación 19, donde el fragmento de cadena ligera humanizado tiene una longitud de aminoácidos de entre desde 95 hasta 235 aminoácidos. 40

21. El método de la reivindicación 15, donde el segundo vector comprende además un dominio constante de cadena pesada humano o fragmento del mismo unido covalentemente al dominio V de cadena pesada humanizado.

22. El método de la reivindicación 11 o 21, donde el dominio constante de cadena pesada humana es uno de un 45 isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

23. El método de cualquier reivindicación precedente, donde el método comprende además purificar el anticuerpo humanizado o dominio V de anticuerpo humanizado a partir de las células hospedadoras para producir una preparación sustancialmente pura del anticuerpo.

24. El método de la reivindicación 23, donde el anticuerpo humanizado sustancialmente purificado se une específicamente a antígeno con una afinidad no menor de una décima parte de la del anticuerpo no humano parental.

25. El método de la reivindicación 24, donde el anticuerpo no humano parental es quimérico.

26. El método de la reivindicación 23, donde el anticuerpo reconoce específicamente y se une a ácido lipoteicoico o factor tisular humano.

27. El método de la reivindicación 15, donde el método comprende además preparar un anticuerpo de cadena única humanizado (sc-Fv) a partir de los dominios V humanizados.

28. El método de la reivindicación 15, 16 o 23, donde el fragmento del anticuerpo humanizado es uno de F (ab') 2, Fab' o Fab.

Fig. 1A. Dominio Variable de Cadena Ligera Anti-Factor Tisular de H36.D3.B7

Fig. 1B. Dominio Variable de Cadena Pesada Anti-Factor Tisular de H36.D3.B7

REGIONES CDR SUBRAYADAS (subrayado sencillo para secuencia de ácido nucleico y subrayado doble para secuencia de aminoácidos) .