Moléculas de fusión y variantes de IL-15.

Un complejo de proteínas de fusión soluble que comprende al menos dos proteínas de fusión solubles,

en donde la primera proteína de fusión comprende (a) un primer receptor de células T de cadena sencilla (scTCR) unido covalentemente a (b) el polipéptido de interleuquina 15 (hIL-15) o un fragmento funcional del mismo; y la segunda proteína de fusión comprende (c) un segundo scTCR unido covalentemente a (d) un polipéptido receptor α de interleuquina 15 soluble (IL-15Ra) o un fragmento funcional del mismo;

en donde el dominio IL15 de la primera proteína de fusión se une al dominio IL-15Ra soluble de la segunda proteína de fusión para formar un complejo de proteínas de fusión soluble

Moléculas de fusión y variantes de IL-15

Antecedentes de la invención Los Receptores de Células T (TCR) son efectores primarios del sistema inmunitario que tienen ventajas únicas como plataforma para desarrollar agentes terapéuticos. Si bien los agentes terapéuticos de anticuerpos se limitan al reconocimiento de patógenos en la sangre y los espacios extracelulares o a dianas proteicas sobre la superficie de la célula, los receptores de células T pueden reconocer antígenos presentados con moléculas del MHC sobre las superficies de las células (incluyendo antígenos derivados de proteínas intracelulares) . Dependiendo del subtipo de células T que reconocen el antígeno presentado y se activan, los receptores de células T y las células T que albergan los receptores de células T pueden participar en el control de diversas respuestas inmunitarias. Por ejemplo, las células T están implicadas en la regulación de la respuesta inmunitaria humoral a través de la inducción de la diferenciación de las células B a células productoras de anticuerpos. Además, las células T activadas actúan iniciando las respuestas inmunitarias mediadas por células. De este modo, los receptores de células T pueden reconocer dianas adicionales no disponibles para los anticuerpos.

Las células T son un subgrupo de células que junto con otros tipos de células inmunitarias (células polimorfonucleares, eosinófilos, basófilos, mastocitos, células B y NK) constituyen el componente celular del sistema inmunitario. En condiciones fisiológicas, las células T funcionan en la vigilancia inmunitaria y en la eliminación de antígenos foráneos. Sin embargo, en condiciones patológicas existe una evidencia convincente de que las células T juegan un papel principal en la causalidad y la propagación de enfermedades. En estos trastornos, el desmoronamiento de la tolerancia inmunológica de las células T, ya sea central o periférica es un proceso fundamental en la causalidad de la enfermedad inmunitaria.

Se cree que los TCR juegan un papel importante en el desarrollo y la función del sistema inmunitario. Por ejemplo, se ha informado de que los TCR median la destrucción celular, incrementan la proliferación de las células B, e impactan en el desarrollo y la gravedad de diferentes trastornos incluyendo cáncer, alergias, infecciones virales y trastornos autoinmunitarios.

Por lo tanto sería deseable proporcionar agentes de direccionamiento novedosos basados en los receptores de las células T, así como métodos para producir y utilizar tales agentes para marcos terapéuticos y diagnósticos. Por consiguiente, sería particularmente deseable proporcionar moléculas que tuvieran ciertas ventajas en comparación con los complejos de la técnica anterior basados en el direccionamiento de anticuerpos.

Por otra parte, es deseable utilizar los TCR para dirigir las diferentes moléculas efectoras al sito de la enfermedad donde pueden proporcionar beneficio terapéutico sin los efectos secundarios asociados con la actividad sistémica no dirigida. Uno de ellos es la IL-15, un miembro de la familia de linfoquinas de cuatro haces de hélices alfa. La IL-15 juega un papel multifacético en el desarrollo y el control del sistema inmunitario. Más específicamente, la IL-15 influye en la función, el desarrollo, la supervivencia, y la proliferación de las células T CD8+, las células NK, las células T asesinas, las células B, los linfocitos intraepiteliales intestinales (LIE) y las células presentadoras de antígenos (CPA) . Se ha demostrado que los ratones transgénicos tanto IL-15-/-, como IL-15Ra-/-carecen de poblaciones de células T NK periféricas y asesinas, ciertos subgrupos de LIE, y la mayor parte de células T CD8+ de fenotipo de memoria, sugiriendo que la IL-15 juega un papel en el desarrollo, la proliferación o/y la supervivencia de estos tipos de células. El receptor (R) de IL-15 consiste en tres polipéptidos, el IL-15R alfa de tipo específico ("IL15Rα" o "IL-15Ra") , el IL-2/IL-15R beta ("IL-2Rβ" o "IL-15Rb") , y la cadena gamma común ("γC, " o "gC" que es compartida por múltiples receptores de citoquinas) .

La señalización de IL-15 se puede producir a través del complejo heterotrimérico de IL-15Rα, IL-2Rβ y γC; a través del complejo heterodimérico de IL-2Rβ y γC. Un mecanismo novedoso de acción de la IL-15 es el de la transpresentación en la que la IL-15 y el IL-15Rα son expresados de manera coordinada por las células presentadoras de antígenos (monocitos y células dendríticas) , y la IL-15 unida al IL-15Rα se presenta en trans a las células T Nk o CD8 próximas que expresan solamente el receptor IL-15RβγC. En cuanto al evento co-estimulador que se produce en la sinapsis inmunológica, la transpresentación de IL-15 parece ser ahora un mecanismo dominante para la acción de IL-15 in vivo y parece jugar un papel principal en la inmunovigilancia tumoral (Waldmann, TA, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601) . Se ha demostrado que las subunidades de IL-2Rα soluble, que inducen isoformas que contienen una deleción del exón 3 y el denominado dominio "sushi" en el extremo N, portan la mayor parte de los elementos estructurales responsables de la unión de las citoquinas. Mientras IL-2Rα solo es un receptor de baja afinidad para la IL-2 (Kd _10 nM) , IL-15Rα se une a IL-15 con una afinidad elevada (Kd_ 100 pM) . De este modo el IL-2Rα soluble y la IL-15 son capaces de formar complejos heterodiméricos estables en disolución y estos complejos son capaces de modular (esto es estimular o bloquear) las respuestas inmunitarias a través del complejo de IL-15R de afinidad elevada o intermedia (Mortier et al. 2006. J Biol Chem 281: 1612-1619; Stoklasek et al. 2006. J Immunol 177: 6072-6080; Rubinstein et al. 2006. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 9166-9171) .

En el documento de Mosquera, Luis A. et al.: "In Vitro and In Vivo Characterization of a Novel Antibody-Like Single

Chain TCR Human IgG1 Fusion Protein", Journal of Immunology, American Association of Immunologists, US, Vol. 174, Núm. 7, 1 de Abril de 2005, págs. 4381-4388 se describe la construcción de una proteína, que está formada por un TCR de cadena sencilla soluble conectado genéticamente al dominio constante de una cadena H de IgG1.

Dados los efectos conocidos de la IL-15 sobre el sistema inmunitario, se han explorado numerosos enfoques basados en IL-15 para manipular el sistema inmunitario en beneficio de los anfitriones. Si bien la administración de IL-15 se ha empleado para reforzar las respuestas inmunitarias o aumentar la reconstitución del sistema inmunitario, el bloqueo de la actividad de IL-15 puede inhibir las respuestas autoinunitarias y otras respuestas inmunitarias no deseadas (Waldmann, TA, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601) . De hecho, una de las limitaciones con el tratamiento sistémico con IL-15 es la posible inducción de enfermedades autoinmunitarias. Otras limitaciones incluyen la dificultad para producir esta citoquina en sistemas de expresión de células de mamífero convencionales así como su vida media muy corta in vivo. Por lo tanto, existe la necesidad de generar una forma terapéutica inmunoestimuladora adecuada de IL-15 que presente una vida media in vivo más prolongada, un aumento de la actividad de unión a células inmunitarias, o un incremento de la bioactividad. Adicionalmente existe la necesidad de antagonistas de IL-15 eficaces. En teoría sería deseable que tales moléculas fueran dirigidas selectivamente al lugar de la enfermedad para evitar toxicidades sistémicas no deseadas y proporcionar un beneficio terapéutico más eficaz.

Compendio de la invención La presente descripción proporciona numerosas variantes de IL-15 y complejos de proteínas de fusión solubles que tienen uso terapéutico y métodos para elaborar tales proteínas.

Las variantes de IL-15 y los complejos solubles descritos en la presente memoria tienen una utilidad terapéutica potencial.

Por consiguiente, la invención proporciona:

1. Un complejo de proteínas de fusión soluble que comprende al menos dos proteínas de fusión, en donde la primera proteína de fusión comprende (a) un primer receptor de células T de cadena sencilla (scTCR) unido covalentemente a (b) el polipéptido de interleuquina 15 (hIL-15) o un fragmento funcional del mismo; y la segunda proteína de fusión comprende (c) un segundo scTCR unido covalentemente a (d) un polipéptido receptor α de interleuquina 15 soluble (IL-15Ra) o un fragmento funcional del mismo;

en donde el dominio IL15 de la primera proteína de fusión se une al dominio IL-15Ra soluble de la segunda proteína de fusión para formar un complejo de proteínas de fusión soluble.

2. el complejo de proteínas de fusión... [Seguir leyendo]

1. Un complejo de proteínas de fusión soluble que comprende al menos dos proteínas de fusión solubles, en donde la primera proteína de fusión comprende (a) un primer receptor de células T de cadena sencilla (scTCR) unido covalentemente a (b) el polipéptido de interleuquina 15 (hIL-15) o un fragmento funcional del mismo; y la segunda proteína de fusión comprende (c) un segundo scTCR unido covalentemente a (d) un polipéptido receptor α de interleuquina 15 soluble (IL-15Ra) o un fragmento funcional del mismo;

en donde el dominio IL15 de la primera proteína de fusión se une al dominio IL-15Ra soluble de la segunda proteína de fusión para formar un complejo de proteínas de fusión soluble.

2. El complejo de proteínas de fusión soluble de la reivindicación 1, en donde el primer scTCR y el segundo scTCR son idénticos, creando de ese modo un complejo de proteínas de fusión de TCR multivalente con una mayor actividad de unión.

3. El complejo de proteínas de fusión soluble de la reivindicación 1, en donde el primer scTCR es específico para el reconocimiento de un antígeno concreto.

4. El complejo de proteínas de fusión soluble de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer o segundo scTCR comprenden una cadena V-a de TCR unida covalentemente a una cadena V-b de TCR por medio de una secuencia conectora peptídica.

5. El complejo de proteínas de fusión soluble de la reivindicación 4, en donde el scTCR comprende adicionalmente un fragmento de la cadena Cb de TCR soluble unido covalentemente a una cadena V-b de TCR.

6. El complejo de proteínas de fusión soluble de la reivindicación 4 o 5, en donde el scTCR comprende adicionalmente un fragmento de la cadena Ca de TCR soluble unido covalentemente a una cadena V-a de TCR.

7. El complejo de proteínas de fusión soluble de la reivindicación 1, en donde el polipéptido IL-15 es una variante de IL-15 que comprende al menos un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de IL-15 nativa, por ejemplo, una o más sustituciones o deleciones de aminoácidos en la posición 8, 61, 65, 72, 92, 101, 108, o 111 de la secuencia de IL-15 humana madura. (SEQ ID NO: 1) , tal como la sustitución de D por N o A en la posición 8, D por A en la posición 61, N por A en la posición 65, N por D en la posición 72 de la secuencia de IL-15 humana madura, N por R en la posición 72 o Q por A en la posición 108 de la secuencia de IL-15 humana madura, o cualquier combinación de estas sustituciones.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la primera proteína de fusión o la segunda proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un vector de ADN que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. El complejo de proteínas de fusión soluble de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un método para estimular o suprimir una respuesta inmunitaria en un mamífero.

11. Un vector de ADN que comprende:

una secuencia de ácido nucleico que codifica la primera proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-7; y una secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1

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