MÉTODOS DE PRUEBA PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN INTRACELULAR DE NUCLEÓTIDOS CÍCLICOS.

Método para determinar la concentración intracelular del nucleótido cíclico AMPc,

caracterizado porque: i)se produce y se usa una célula, que expresa junto con una fotoproteína sensible a Ca2+ los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5 y ii)se determina la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos mediante la señal de luminiscencia de la fotoproteína

Métodos de prueba para determinar la concentración intracelular de nucleótidos cíclicos.

La invención se refiere a métodos para el análisis óptico cuantitativo de la concentración intracelular de guanosín 3',5'-monofosfato cíclico (GMPc) o adenosín 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc). Estos procedimientos pueden ser útiles para identificar y evaluar las propiedades farmacológicas de sustancias de prueba que influyen en la actividad de receptores o enzimas implicados en la síntesis o degradación de los nucleótidos cíclicos GMPc y AMPc. Como resultado, el procedimiento es adecuado, por ejemplo, para encontrar moduladores de receptores acoplados a proteínas G (GPCR), NO sintasas, fosfodiesterasas (PDE) y guanilato ciclasas solubles y unidas a membrana.

La invención describe un método en el que se miden las concentraciones intracelulares de GMPc o AMPc con la ayuda de líneas celulares recombinantes. Estas líneas expresan de manera recombinante una combinación de canales iónicos particulares activados por nucleótidos cíclicos (canales CNG), una fotoproteína sensible a calcio y un receptor o una enzima para los que deben encontrarse moduladores. El procedimiento es adecuado para la automatización y para la selección de alto rendimiento (HTS) y la selección de ultra-alto rendimiento (uHTS) de moduladores.

Los métodos actuales para medir la concentración intracelular de GMPc o AMPc tienen la desventaja de ser muy costosos, debido al uso de radioactividad, de poder automatizarse sólo parcialmente, como mucho, y de ser muy complicados.

Los sistemas comerciales convencionales para determinar GMPc y AMPc son técnicas radioactivas tales como el radioinmunoensayo (RIA; por ejemplo de IBL, Hamburgo, Alemania), el ensayo de proximidad por centelleo (SPA; Amersham Bioscience, RU) y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas no radioactivo (ELISA; por ejemplo de Amersham Bioscience, RU).

Los métodos descritos anteriormente no pueden usarse para medir las concentraciones intracelulares de GMPc y AMPc en células vivas "in situ". Para llevar a cabo las mediciones, tienen que romperse las células y entonces extraerse los nucleótidos cíclicos.

Otro método para medir el AMPc intracelular es la medición con la ayuda de sistemas de promotores inducibles ("elemento de respuesta a AMPc", CRE) y la enzima luciferasa (Goetz et al., J. Biomol. Screen. (2000) 5 377-384). Sin embargo, el método tiene la desventaja de que tienen que producirse tanto la transcripción como la traducción para que se forme la señal, lo que provoca que la medición dure horas. Este método, por tanto, no es adecuado para la medición rápida de las concentraciones de AMPc reales en las células.

El objeto de la invención es encontrar un método no radioactivo, mejorado para medir las concentraciones intracelulares de GMPc y AMPc. La intención en este caso es poder llevar a cabo las mediciones muy rápidamente y también con alta sensibilidad. El método debe automatizarse y debe ser adecuado para la selección de alto rendimiento de muestras o compuestos de prueba (HTS y uHTS).

Los compuestos de prueba según la invención son preferiblemente compuestos químicos de moléculas pequeñas que tienen un peso molecular de desde 100 hasta 500 o desde 100 hasta 1000 o si no mayor que esto. Estos compuestos pueden usarse individualmente o si no como una mezcla en el procedimiento según la invención. Los compuestos de prueba según la invención también incluyen anticuerpos, sustancias naturales, extractos de sustancias naturales, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. Esta lista debe considerarse sólo a modo de ejemplo y no como limitativa.

Con el fin de establecer un sistema de selección para enzimas y receptores que influyen en el nivel intracelular de AMPc o GMPc, se transfectan diversos canales iónicos activados por nucleótidos cíclicos (canales CNG), solos o en diversas combinaciones, en células que expresan adicionalmente una fotoproteína sensible a calcio de una manera recombinante. Posteriormente se transfectan estas células con diversas enzimas o receptores con el fin de someter a prueba la idoneidad de las células para la selección de alto rendimiento. Esto implica usar, por ejemplo, guanilato ciclasa soluble, dado que puede producir GMPc intracelular tras la estimulación. Un ejemplo de un receptor que puede usarse es el receptor β-adrenérgico que, tras una activación, induce un aumento en la concentración intracelular de AMPc.

Los canales CNG son proteínas integrales de membrana que se abren con los nucleótidos cíclicos GMPc y AMPc. Esta familia de canales iónicos son canales catiónicos no selectivos que son permeables a iones sodio, potasio y calcio. Los canales funcionales están compuestos de cuatro subunidades idénticas o si no diferentes (homo o heterotetrámeros). Puede influirse en las sensibilidades a GMPc y AMPc combinando diversas subunidades (Biel et al. TCM (1996) 6, 274-280; Kaupp y Seifert, Physiol. Rev. (2002) 82, 769-824). Se han clonado y publicado las subunidades de canal CNG1-CNG6 que, según una nomenclatura más reciente, también se denominan CNGA1-CNB3 (Bradley et al., Science (2001) 294, 2095-2096). También existen variantes de corte y empalme tales como CNG4.3, por ejemplo (Sauter et al., PNAS (1998) 95, 4696-4701). El documento DE 101 388 76 A da a conocer el uso de líneas celulares que contienen canales CNG para determinar la concentración intracelular de Ca²⁺.

El aumento de la concentración intracelular de GMPc o AMPc da como resultado la apertura de los canales CNG y de ese modo un flujo de entrada de iones calcio. Entonces puede detectarse el calcio entrante con la ayuda de indicadores fluorescentes sensibles a calcio, tales como, por ejemplo, FURA, Fluo-3 etc., o con la ayuda de las fotoproteínas sensibles a calcio tales como aequorina u obelina.

La fotoproteína aequorina que se deriva de la medusa Aequorea victoria es un indicador de calcio altamente sensible en células. El complejo de aequorina consiste en la proteína apoaequorina, oxígeno molecular y la coelentarazina luminófora. Este complejo emite luz azul en presencia de calcio (iones Ca²⁺), con el máximo de emisión a 466 nm (Jones et al., Trends Biotechnol. (1999) 17, 477-481).

Otra fotoproteína es la obelina que se ha clonado de diversos hidrozoos tales como Obelia longissima, por ejemplo. Ésta consiste en apoobelina, O₂ y el luminóforo coelenterazina. Asimismo, se emite luz azul en presencia de calcio (Illarionov et al., Métodos Enzymol. (2000) 305, 223-49).

Las guanilato ciclasas son responsables de producir GMPc a partir de GTP. Se hace una distinción entre las guanilato ciclasas solubles y las unidas a membrana. La guanilato ciclasa soluble es un heterodímero compuesto de una subunidad alfa 1 y una subunidad beta 1. Es un receptor natural del monóxido de nitrógeno (NO) producido por la NO sintasa endotelial y por tanto también puede activarse farmacológicamente por sustancias liberadoras de NO tales como, por ejemplo, Sie-1. Dado que el GMPc producido por la guanilato ciclasa induce la relajación de los vasos sanguíneos, la enzima es una diana farmacológica altamente interesante (Hobbs AJ., TIPS (1997) 18, 484-491). Las guanilato ciclasas unidas a membrana tienen un segmento transmembrana y se activan con diversos agonistas tales como ANP, BNP, CNP o guanilina (Wedel y Garbers, Annual Rev. Physiol. (2001) 63, 215-233).

Otra familia de proteínas farmacológicamente interesante son los "receptores acoplados a proteínas G" (GPCR). Estos son proteínas integrales de membrana que pueden transducir la acción de una hormona extracelular hacia el interior de la célula. Se influye en los niveles intracelulares de AMPc o de calcio mediante el acoplamiento de estos receptores a diversas proteínas G. La activación de los "receptores acoplados a Gq" da como resultado una liberación de calcio de reservas internas y por tanto un aumento en la concentración citoplasmática de calcio. La activación de los "receptores acoplados a Gs" da como resultado un aumento en la concentración de AMPc, mientras que la activación de los "receptores acoplados a Gi" reduce el contenido intracelular de AMPc (Gurrath M., Curr. Med. Chem. (2001) 8, 1605-1548). Un ejemplo de receptores acoplados a Gs son los "receptores β-adrenérgicos" que pueden estimularse con la ayuda de agonistas tales como isoprenalina (Dzimiri N., Pharmakol. Rev. (1999)...

1. Método para determinar la concentración intracelular del nucleótido cíclico AMPc, caracterizado porque:

2. Método según la reivindicación 1, en el que la fotoproteína es aequorina.

3. Método según la reivindicación 1, en el la fotoproteína es obelina.

4. Método de selección de compuestos de prueba para la identificación de ligandos de receptor, usando un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula usada expresa el receptor y tiene un sistema mensajero intracelular, que permite que un enlace receptor-ligando induzca una modulación medible del flujo de iones a través del canal iónico, se incuba esta célula con las sustancias de prueba y se seleccionan tales sustancias de prueba que modulan la luminiscencia.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el receptor es un receptor acoplado a proteínas G.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el receptor acoplado a proteínas G es un receptor huérfano.

7. Método para seleccionar compuestos de prueba para identificar moduladores de fosfodiesterasas, usando un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula usada expresa la fosfodiesterasa, se incuba esta célula con las sustancias de prueba y se seleccionan tales sustancias de prueba que modulan la luminiscencia.

8. Célula, que expresa los canales iónicos activables por nucleótidos cíclicos CNG2(T537A)/CGN4.3/CNG5 y una fotoproteína sensible a Ca²⁺.